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RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1）试剂配制1.0.1%DEPC水：1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下静置4小时。（①用来泡使用器具处理12小时；②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。）2.氯仿3.异丙醇4.75%乙醇：用无水乙醇和高压后的DPEC水配制，现配现用。2）操作步骤：1.样品处理a.组织：将组织放在液氮中磨碎（低温处理）。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。b.单层培养细胞；直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞，每10cm2面积加1mLTRZOL。用取样器抽打几次。（注意：裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。）c.细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。d.血液：直接取新鲜血液，加入3倍体积RZ（推荐0.25mL血液+0.75mLRZ），充分震荡混匀。2.将裂解样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白质复合物完全分离。3.4℃12,000rpm离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。（注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。）4.加入1/5体积氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。5.4℃12,000rpm离心15分钟，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，将水相转移到新管中。6.缓慢加入等体积异丙醇，室温静置5分钟。7.4℃12,000rpm离心10分钟,。8.洗脱沉淀：弃上清，向沉淀中加入1mL的75%无水乙醇，震荡混匀，4℃12,000rpm离心5分钟。9.弃上清，通风厨内挥干75%无水乙醇，加入适量（20~30μL）DEPC水溶解后放置-80℃保存。预防RNase污染，应注意以下几方面：1.经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。3.RNA在TRNzol试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4.配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),放置过夜，高压灭菌。）二、DNA去除及cDNA扩增1）基因组DNA的除去反应。试剂使用量5×gDNAEraserBuffer2μLgDNAEraser1μLTotalRNA*1RNaseFreedH2OUpto102μL42℃2min(或者室温10min)4℃2）反转录反应。试剂使用量5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)4μLPrimeScripeRTEnzymeMixI1μLRTPrimerMix1μL1.的反应液10μLRNaseFreedH2OUpto20μL37℃15min85℃5s4℃*120μL反应体系可最大使用1μg的TotalRNA注意事项：1.避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处于融化状态。2.试剂盒各组成成分应在-20℃保存。3.cDNA产物应置于-20℃保存。三、PCR反应1）PCR反应体系：模板cDNA0.5μL2×PCRMaster12.5μL灭菌ddH2O11μL上游引物0.5μL下游引物0.5μLTotal25μL2）反应条件：94℃5min94℃30s55℃30s30-35cycles(具体反应体系根据自己需求改变条件)72℃30s72℃5min4℃∞扩增产物-20℃保存。四、PCR产物电泳1）试剂配制1.50×TAE：TrisBase24.2gEDTANa23.72gddH2O60mL混匀后加入5.71mL冰醋酸定容至100mL，4℃保存备用，使用时稀释成1×工作液。2.6×上样缓冲液（4℃保存）：溴酚蓝0.0025g，蔗糖0.4g，双蒸水定容至1mL。3.EB替代品（20mL琼脂糖凝胶加入0.5μL，30mL琼脂糖凝胶加入0.8μL）2）操作步骤1.制胶：①2%琼脂糖凝胶（跑cDNA）：0.6g琼脂糖加入30mL1×TAE中，微波炉中高温熔化2-3次，每次1min，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入EB替代品，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min充分凝固，转入电泳槽。②1%琼脂糖凝胶（跑RNA）：0.3g琼脂糖加入30mL1×TAE中，RNA容易感染，所以跑的时候最好用新配。2.加样：①跑cDNA（2ul6*buffer与10ul的cDNA混匀后取10ul加到凝胶孔中）Maker：5μL样品：5μL电泳条件：120V，15min②跑RNALoadingbuffer1μL1×TAE3μLRNA2μL电泳：100V左右电泳30--40分钟。扩增条件：U6和microRNA-199a：94℃3min94℃30s60℃30s30cycles72℃30s72℃5min4℃∞注：电泳跑胶时间10-15min，U6和microRNA-199a分子量小不需要跑那么长时间，时间跑长了反而会出现两条条带。GAPDH和Mn-SOD：94℃3min94℃30s55℃30s30cycles72℃30s72℃7min4℃∞CHOP和Caspase12：94℃3min94℃30s51℃30s35cycles72℃30s72℃5min4℃∞