PCR法支原体检测

1/8PCR法支原体测定PROTOCOL关键词PCR、支原体修订记录姓名部门/职务签名日期（年-月-日）起草人审核人批准人生效日期（年-月-日）有效期至（年-月-日）分发部门：质量部2/81.目的规范PCR法支原体检测的操作方法。2.范围适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。3.责任质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。4.定义N/A5.设备、材料和试剂5.1设备、材料设备名生产商型号/货号备注PCR仪ThermoARKTIK5020N/AVORTEXIKAGENIUS3N/A小型台式冷冻离心机ThermoHERAEUSFresco21N/A单道移液器(10ul,20ul,100ul)EppendorfResearchplusN/A多功能水平电泳槽TanonHE-120N/A凝胶成像系统BIORADChemiDoc™XRS+SystemN/A5.2试剂试剂名称生产商货号TaKaRaPCRMycoplasmaDetectionSetTaKaRa6601TaKaRaExTaq®TaKaRaRR001ARegularAgaroseG-10BiowestN/AGoldview国产N/A3/810×LoadingBufferTaKaRa9157DL5000DNAMarkerTaKaRa3428A内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司6.溶液配制6.150×TAEBuffer称取242.0gTris，37.2gNa2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。6.21×TAEBuffer量取10ml50×TAEBuffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。7.操作步骤用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入ControlTemplate进行正对照反应。7.11stPCR反应7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系）试剂用量（ul）内毒素检查用水37.75~38.7510×PCRBuffer5dNTPMixture4MCGpF1Primer0.5MCGpR1Primer0.54/8TaKaRaTaq0.257.1.2向以上反应混合液中分别加入1ul阴性对照样品（内毒素检查用水），1ul供试品，1ul阳性对照样品(ControlTemplate)和2ul供试品阳性对照（1ul供试品+1ulControlTemplate)，添加样品时务必防止交叉污染。为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水（阴性对照），再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ulControlTemplate（阳性对照）及“1ul供试品+1ulcontrolTemplate”（供试品阳性对照）。7.1.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。94℃30sec94℃30sec55℃2min35cycles72℃1min72℃5min7.22ndPCR反应7.2.1按下表顺序配制反应混合液试剂用量(ul)内毒素检查用水39.2510×PCRBuffer5dNTPMixture4MCGpF2Primer0.5MCGpR2Primer0.5TaKaRaTaq0.257.2.2用内毒素检查用水将1stPCR反应产物稀释100倍，取0.5ul加入以上反应混合液中。为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，具体加样方式同7.1.2。7.2.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。94℃30sec5/894℃30sec55℃2min30cycles72℃1min72℃5min7.3扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析7.3.11%琼脂糖凝胶的制备称取0.4gRegularAgaroseG-10，加入约40ml1×TAEBuffer（大于40ml），置于微波炉中中高火加热2min，摇匀，再加热2min。稍微冷却后加入1ulGoldview，振荡摇匀，倒入胶槽中，冷却30min左右直至凝固。取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中，加入1×TAEBuffer直至超过凝胶2mm左右。7.3.2上样取1st和2ndPCR产物各10ul，加入1.1ul10×LoadingBuffer，混匀后，取10ul上样，用6ulDL5000DNAMarker作为对照。7.3.3电泳及分析调节电压120V，电泳1h。取出凝胶置于凝胶成像系统，拍照并分析确认扩增片段的有无及片段大小。8.数据分析8.1Control实验（阴性对照，阳性对照，供试品阳性对照）本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品；以ControlTemplate作为阳性对照样品；以“供试品+ControlTemplate”作为供试品阳性对照样品。使用ControlTemplate时，F1和R1引物扩增产物是810bp（见图1，泳道5、6），F2和R2引物扩增产物是590bp（见图1，泳道11、12）。当阴性对照结果呈阴性，阳性对照结果呈阳性，此反应系统可行。当供试品阳性对照结果呈阳性，说明待测样品对PCR反应无阻碍；如果供试品阳性对照结果呈阴性，说明检测样品中有阻碍物，建议将检测样品进行DNA提取，再以其作为模板进行扩增。6/8图11、DL5000Marker；2、H2O-1(1st)；3、H2O-2(1st)；4、待测样品；5、待测样品+control(1st)；6、control(1st)；7、H2O-3(1st)；8、H2O-1(2nd)；9、H2O-2(2nd)；10、待测样品(2nd)；11、待测样品+control(2nd)；12、control(2nd)；13、H2O-3(2nd)8.2供试品检测若待测样品检测结呈阴性，说明无支原体污染，若待测样品有条带，则进一步确认片段大小。表1是以12种MycoplasmaDNA分别作为模板，2对引物进行扩增所得到的片段大小。图2是12种MycoplasmaDNA，取1ng进行两轮PCR反应（反应体积为100ul）后的电泳结果。表112种Mycoplasma属的扩增片段大小123456789101112137/8图212种MycoplasmaDNAPCR反应后电泳结果8.3问题分析8.3.1.ControlTemplate是用于检测PCR反应性能的。当加入ControlTemplate时，即使检测样品中含有Mycoplasma，也可能没有扩增获得与Mycoplasma相对应的片段，因此不要使用ControlTemplate添加的反应进行样品的结果判定。为了获得准确的样品检测结果，在做PCR反应时，要保证检测样品是唯一的模板。8.3.2.当检测样品中含有大量Mycoplasma时，有时可能只有样品中Mycoplasma的片段扩增，而正对照的ControlTemplate片段却没有扩增。8.3.3.ControlTemplate是人工合成的，序列中不含Mycoplasma的内部序列。8.3.4使用含有10%FCS的DMEM、RPMI培养基，接种后进行3-6天的细胞培养，上清液可以按反应体系的1/10的量直接添加的PCR反应液中，经确认可以扩增mycoplasmaDNA。8.3.5已确认FCS原液按反应体系1/10的量直接添加到反应液中不会阻碍PCR反应。9.参考资料N/A8/810.相关文件N/A11.附录N/A