PCR鉴定乳酸菌.

应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌微生物学通报[e-mail].20,2014,41(4):674−680©2014byInstituteofMicrobiology,CAS摘要目的:植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌是微生物肥料生产中常用的乳酸菌，它们表型特征相似，若采用传统方法鉴定则费时费力，为准确、快速地鉴定这些菌种，建立种特异PCR方法。方法:利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)，以GenBank数据库中上述菌种的recA和gyrB为靶基因，设计和筛选种特异性引物从而建立相应特异PCR鉴定方法。摘要结果：经过乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和假单胞菌属7个属24个种共40株标准菌株的实验验证，4个目标种分别扩增出唯一的目的产物，而其他种均无目的扩增产物。采用建立的4种特异PCR方法对产品中分离的16株乳杆菌进行鉴定，结果与16SrDNA序列分析、Biolog鉴定结果一致。摘要结论：建立的特异PCR鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性，可快速、准确的用于微生物制剂中植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌的检测和鉴定，具有较好的应用前景。引言乳酸菌是指能发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。具有多种重要的生理功能，是食品和药品行业中的重要菌种。在微生物肥料行业，以乳酸菌(主要是乳杆菌)作为有效菌的产品越来越多，准确的识别和鉴定微生物制剂中的各种菌是产品质量判定的重要依据，而选择一种快速而准确的鉴定方法尤为重要。引言乳杆菌属的许多种其菌体、菌落形态特征相似难辨，生理生化特性也存在许多相似之处。传统的生理生化试验耗时费力，Biolog快速鉴定系统、脂肪酸分析等测定繁琐、成本高，不能满足微生物肥料检测中的快速、准确的需要。至今已有许多分子鉴定技术和分类方法被用于乳酸菌的分类和鉴定。其中，特异(引物)PCR技术简单、快速、准确及成本低。引言本实验以微生物肥料中常见的植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌为材料，用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)设计种特异性引物，而后通过优化PCR反应的退火温度、引物浓度、Mg2+等关键因子，建立4种菌的快速鉴定特异PCR方法，应用于微生物肥料产品检测过程中的菌种识别与鉴定，以提高质检效率。材料与方法1.2.1基因组DNA模板的制备：乳酸菌接种MRS琼脂培养基，37°C厌氧培养16−24h，胶冻样类芽孢杆菌接种于硅酸盐细菌培养基，其他菌株接种于营养琼脂，30°C培养16−24h，用无菌水收集培养物，参照Bead-beater法并作一定改进快速提取各菌株的基因组DNA。材料与方法1.2.2种特异性PCR引物设计：通过分析比较GenBank数据库中上述菌种及其相近种的16SrRNA、gyrB、recA、hsp60、16S-23SITS、lacZ等基因序列的差异，确定植物乳杆菌和德氏乳杆菌引物设计的靶基因为recA(重组蛋白基因)，鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌为gyrB(促旋酶基因)。利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)设计引物并同时在GenBank数据库中进行引物特异性验证，最终筛选出上述特异性引物各1对，分别为planF/planR(植物乳杆菌特异引物)、aciF/aciR(嗜酸乳杆菌特异引物)、delF/delR(德氏乳杆菌特异引物)和rhaF/rhaR(鼠李糖乳杆菌特异引物)。表2为各引物序列。材料与方法1.2.3特异PCR反应体系及程序：以参考菌株的基因组DNA为模板，利用设计好的特异性引物进行PCR扩增。PCR反应总体系为20L，包括10×PCRBuffer(不含Mg2+)2.0μL，MgCl2(25mmol/L)1.6μL，dNTPmixture(各2.5mmol/L)1.6μL，引物F(20μmol/L)、引物R(20μmol/L)各0.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA50ng，加无菌重蒸水补足至20μL。PCR扩增程序：94°C3min；94°C60s，67°C45s，72°C60s，共30个循环；72°C10min，4°C保存。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。材料与方法1.2.4PCR特异性验证实验：用4对引物分别对40株参考菌株进行扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.5特异PCR产物测序：对菌株L.plantarumCGMCC1.2437T，L.rhamnosusACCC10534T，L.acidophilusCGMCC1.1878T，L.delbrueckiisubsp.delbruekiiCGMCC1.2624T的PCR产物进行测序，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。1.2.6生产菌株的检测：采用Biolog方法和16SrDNA序列分析方法对16株从微生物肥料产品中分离的乳杆菌进行鉴定，然后分别用4对引物采用特异PCR方法对其进行鉴定，检验本实验建立的特异PCR方法与其他方法鉴定结果是否一致。材料与方法1.2.716SrDNA序列分析方法：以生产菌株基因组DNA为模板，采用通用引物27F和1492R进行16SrDNA扩增，PCR产物经纯化后测序，所测16SrDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较。反应体系(50μL)：10×PCRbuffer5.0μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPmixture(各2.5mmol/L)5μL，引物27F和1492R(10μmol/L)各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA100ng，加无菌重蒸水补足至50μL。扩增程序：95°C5min；93°C60s，50°C60s，72°C70s，共30个循环；72°C10min；4°C保存。结果2.1乳杆菌PCR方法的特异性检测：使用4对特异引物分别对31株乳杆菌属参考菌株(表1)进行PCR扩增，结果显示，所有目标菌株中1株嗜酸乳杆菌CGMCC1.2467除外，均产生唯一目的条带，非目标菌株均没有扩增出目的条带。图1A、B、C、D显示的是各个目标种所有菌株及非目标种代表菌株的PCR结果。将嗜酸乳杆菌CGMCC1.2467基因进行16SrDNA扩增，测序后与GenBank数据库和RDP数据库中相关种属的序列进行比较，结果均显示与鼠李糖乳杆菌的序列一致性最高，达到100%；采用Biolog对该菌进行鉴定，结果也是鼠李糖乳杆菌。利用鼠李糖乳杆菌特异引物对该菌进行特异PCR，扩增结果为阳性(图1D)。结果使用4对特异引物分别对9株非乳杆菌属参考菌株(表1)进行PCR扩增，且分别以一株目标菌株为阳性对照。结果除阳性对照出现目标条带外，其余均没有目的扩增产物。以上结果表明，建立的4种特异PCR鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性。结果2.2PCR产物序列分析：对模式菌株L.plantarum1.2437T、L.rhamnosus10534T、L.acidophilus1.1878T和L.delbrueckiisubsp.delbruekii1.2624T的特异PCR产物进行测序，结果通过GenBank中BLAST比对，与数据库中的同一区段核酸序列的一致性均达到99%或100%，结果说明各特异性引物具有很强的忠实性、特异性和保守性。结果2.3生产菌株的检测：16株生产菌株的4次特异PCR结果、16SrDNA序列在GenBank和RDP两个数据库中的综合分析结果和Biolog鉴定结果见表3。其中11株菌产生了唯一扩增条带，根据片段大小分属于嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，其16SrDNA序列分析结果和Biolog鉴定结果均与其一致，另外5株菌无扩增产物，序列分析和Biolog鉴定的结果显示是布氏乳杆菌、类布氏乳杆菌、干酪乳杆菌和类干酪乳杆菌。以上结果表明特异PCR方法可用于微生物肥料中这4种菌的快速检测鉴定，并且乳杆菌属其它种的特异PCR方法还有待建立。另外，因L-13和L-16的16SrDNA序列分别与2种菌的序列一致性达到99%以上，不能确定到某个种，故表中给出2个菌名，这也证实了16SrDNA序列分析不适合乳杆菌相近种的鉴定。讨论16SrDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系的研究已被普遍接受和广泛应用，并且已作为细菌分类鉴定的有力佐证。但是乳杆菌属内许多种的16SrRNA基因序列具有较高同源性，利用该方法无法准确鉴定到种，本实验2株生产菌株的16SrDNA序列分析结果也证实了这一观点。研究表明，gyrB、recA、rpoD、hsp60等基因序列更适合细菌的系统发育分析，用作引物设计的靶基因，较16SrDNA序列更好地区分相似种。讨论本实验以gyrB、recA为靶基因设计了4种乳杆菌的特异性引物，经乳杆菌属多个种、目标种的相近种以及微生物肥料产品中非乳杆菌属代表种的验证实验，证明建立的PCR鉴定方法具有很高的特异性，能够准确鉴定植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌。对16株从产品中分离的乳杆菌进行鉴定，其16SrDNA序列分析结果、Biolog鉴定结果与特异PCR结果均一致，说明本文所建立的特异PCR鉴定方法具有良好的可靠性和准确性，为微生物肥料检测过程中菌种的识别鉴定提供了简便、快捷的手段，具有很好的推广应用前景。讨论乳杆菌属菌株具有很高的同源性，一些菌株因没有更深入研究有可能被定错种名，本文采用的参考菌株嗜酸乳杆菌CGMCC1.2467即是如此，其16SrDNA序列分析结果、Biolog鉴定结果以及本实验建立的特异PCR鉴定结果均表明CGMCC1.2467为鼠李糖乳杆菌。由此看来，特异PCR技术不仅可以用于未知菌株的鉴定，也可以用于更正一些菌株的分类错误。