PCR技术•PCR技术简史•PCR的基本原理•PCR技术的应用DNA体外快速扩增技术PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’GGAUCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’AUCGCG5‘ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA的变性与复性变性复性加热退火PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA的变性与复性变性复性加热退火PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA的变性与复性1971年,Khorana提出:经过DNA变性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,所以,Khorana的设想被人们遗忘了……变性复性加热退火PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明1985年,美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(PCR)基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年,Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294时间(min)温度(℃)适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点1234522557294时间(min)温度(℃)适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点电泳分析PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点电泳分析PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液,2~4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA