pepc酶活的测定

2.实验试剂：50mMATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mMNaHCO3溶液，160U/ml磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mMRuBP溶液，5mMNADH，Rubisco提取介质（40mMTris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mMMgCl2溶液，0.25mMEDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1MTris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mMMgCl2溶液，0.4mMEDTA）。3实验步骤3.1酶粗提液的准备取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。3.3.2Rubisco酶活力的测定按下表配制反应体系：试剂加入量ml5mMNADH0.250mMATP0.2酶提取液0.150mM磷酸肌酸0.20.2mMNaHCO30.2反应介质1.4160U/ml磷酸肌酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶0.1双蒸水0.3将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。以零点到第1min的OD值下降的绝对值计算酶活力。由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。计算酶活力变化时应减去这一变化量。3.3.3Rubisco活力的计算酶活力=（ΔODN10）/（6.22×2dΔt）式中：ΔOD为反应最初1min内340nm处OD值变化的绝对值（减去对照液最初1min的变化量）；6.22为每mmolNADH在340nm处的光密度；N为酶液稀释倍数；2表示每固定1mol的CO2有2mol的NADH被氧化；d为比色杯光程（cm），Δt表测定时间为1min；酶活力单位为mmolCO2/ml(酶液).min。注意：RuBp不稳定，最好现配现用。μmol/gfreshweight·h4条斑紫菜丝状体和条斑紫菜叶状体磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性差异的研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶广泛存在与高等植物、细菌以及藻类中，催化磷酸烯醇式丙酮酸和碳酸氢根形成草酸乙酸，该反应不可逆，是C4植物光合途径中的关键酶，起着固定原初CO2的作用。在细菌中对三羧循环起着调节作用。本实验用偶联法测定酶的活性。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在PEP、H2CO3、Mg2+存在时，形成草酸乙酸，而草酸乙酸在NADH及苹果酸脱氢酶存在下可生成苹果酸及NAD，NAD形成的速度可在340nm处进行测定，并以OD值下降0.01作为一个酶活性单位（王维光，1985；张志良等，2003）。4.1器材与试剂4.1.1实验仪器：UnicoUV-2100specterometer紫外分光光度计，冷冻高速离心机，秒表，移液枪研钵。4.1.2实验试剂：提取缓冲液[0.1MTris-H2SO4缓冲液，pH8.2，含7mM巯基乙醇（547mg/L），1mMEDTA（292mg/L），5%的甘油]，洗脱缓冲液[10mMTris-H2SO4缓冲液，含0.2mMEDTA（58mg/L），0.2mM二硫苏糖醇（31mg/L），5%的甘油，pH8.2]，反应缓冲液[50mMTris-HCl缓冲液，pH9.2]，反应混合液[0.5ml70mMMgSO4（17.3mg/L），0.5ml70mMNaHCO3，1ml14mMPEP（2.9mg/L）混合，以上溶液都用反应缓冲液配制。需用时再加入1.5ml内含0.35mgNADH及过量的苹果酸脱氢酶的反应缓冲液]。4.2实验步骤4.2.1酶提取液的准备取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用。4.2.2PEPC酶活力的测定于石英比色杯中加入反应混合液3.5ml，并加入1ml粗酶液混匀后启动反应，立即与分光光度计340nm处按3min，20s间隔读取OD值，以OD值下降0.01作为一个酶活力单位。UV-B辐射对苜蓿幼叶内Rubisco、H2O2含量及蛋白水解酶活性的影响[3]MakinoA,MaeT,OhiraK.ColorimetricmeasurementofproteinwithCoomassiebrilliantblueRonsodiumdodecylsul-fate-polycarylamidegelelectrophoresisbyelutingwithfor-mamide[J].AgrBiolChem,1986,50:1911-1912·2.PEPC于花后15d和20d每品种各处理分别取样15株冬小麦带回实验室,旗叶和穗器官分开,在液氮中迅速冷冻并置于-80℃冰柜用于测定旗叶、颖片和籽粒PEPC活性。酶的提取按Sayre[27]方法进行。酶活性测定采用Blanke[28]的酶偶联法。[27]SayreRT,KennedyRA.PhotosyntheticenzymeactivitiesandlocalizationinMollugoverticillatapopulationsdifferingintheleavesofC3andC4cycleoperation[J].PlantPhysiology,1979,64:293-299.[28]BlankeMM,EbertG.Phosphoenolpyruvatecarboxylaseandcarboneconomyofappleseedlings[J].JournalofExperimentalBotany,1992,43:965-968.JiangD-A(蒋德安),LuQ(陆庆),WengX-Y(翁晓燕),etal.RegulationofRubiscocarboxylationactiv-ityandphotosyntheticratebyRubiscoactivaseduringleafsenescenceinrice.JournalofZhejiangUniversity(AgricultureandLifeSciences)(浙江大学学报·农业与生命科学版),2000,26(2):119-124(inChi-小麦Rubisco的纯化、鉴定及其活性测定Rubisco活化酶的分子生物学1.PEPC酶活的测定参照Ku等人的方法。在光照条件下，剪取转基因植株和非转基因植株的第五片叶0.1g左右，快速加入1.5ml蛋白质提取缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.0，10mMMgCl2，1mMEDTA，5mMDTT，5%聚乙烯吡咯烷酮，10%甘油），在冰上研磨至匀浆状，将匀浆液转移至1.5ml微量离心管中，4℃15000×g离心15min，取上清转移到新离心管中，此上清液即为酶粗提物。在室温条件下检测PEPCase活性，其检测缓冲液为50mMtricine-KOH，pH8.0，0.1mMEDTA，1mMDTT，10mMMgCl2，10mMNaHCO3，3UNAD-苹果酸脱氢酶，0.2mMNADH，1ml反应体系中加入10μl蛋白质提取物，加入2mMPEP后开始计时，记录反应开始时OD340的值和5min后OD340的值，根据OD340值的变化来计算PEPCase活性。Animprovedspectrophotometricassayforribulosebisphosphatecarboxylase