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超氧化物歧化酶的研究进展学生：杨青青生命科学院10级研究生摘要：超氧化物歧化酶是一种广泛存在于生物体内各个组织中的重要金属酶，是一种能够特异性清除机体代谢过程中产生的自由基的抗氧化酶，近年来成为化学、生物学、医学、日用化工、食品科学和畜牧兽医学等多个学科领域研究的热点。深入研究SOD及其与机体内铜、锌、铁、锰等元素代谢的关系，不仅有着重要的理论意义，而且具有重要的实用价值。本文将从其来源、种类和分布、结构和理化特性、作用机理及生理功能、SOD基因的克隆和表达、分离纯化、制备开发应用等方面进行综述，并探讨和分析了目前存在的问题及应用前景，旨在为超氧化物歧化酶的研究、开发、应用提供参考。关键词：超氧化物歧化酶；基因克隆；蛋白表达；分离；纯化；应用ResearchAdvancesinSuperoxideDismutaseStudent:YangQing-Qing10graduatestudent,Schooloflifescience,ShanghaiUniversityAbstract:Superoxidedismutaseisanimportancemetalenzymeofwidelyvarioustissuesinvivo,whichisanantioxidantenzymescanspecificallyremovefreeradicalsproducedduringmetabolismandhasbeenaninquiringhotspotsinmanyfieldssuchaschemistry,biology,medicine,dailychemicalindustry,foodscienceandanimalhusbandryandveterinaryscienceandsooninrecentyears.ItnotonlyhasanimportanttheoreticalsignificancebutisofanimportantpracticalvaluetostudytherelationshipbetweenSODandtheelementarymetabolismofcuprum(Cu),zine(Zn),ferrum(Fe)andmanganese(Mn).Thisarticlewillnotonlysummarizefromitssource,typeanddistribution,structureandphysicochemicalproperties,functionmechanismsandphysiologyfunctions,SODgenecloningandexpression,purificationdevelopmentapplicationsbutalsoanalyzeanddiscusstheproblemsandprospectsofthefutureaimingatprovidingreferencefortheresearch,developmentandapplicationofSOD.Keywords:Superoxidedismutase;Genecloning;Proteinexpression;Isolation;Purification;Application前言氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都是直接或间接由氧转化而成的。由于它们都含有氧，而且具有较活泼的化学反应特性，遂统称为活性氧(Activeoxygenspecies，AOS)[1]。包括超氧根离子O2-、氢氧根离子OH-、经自由基(·OH)过氧化氢H2O2、单线态氧(1O2)和过氧化物自由基(ROO-)。它们可导致膜脂过氧化、碱基突变、链的断裂和蛋白质的损伤，等。植物体在正常生长条件下也能产生少量的O2-，它主要来源于线粒体的电子转移系统、光合作用，以及一些氧化还原酶的产物[2]。但在正常的生理情况下，活性氧在不断产生，也不断地被清除，因而不会造成自由基对机体的损伤。活性氧在植物体内的清除由保护酶和抗氧化物质来完成。保护酶主要是超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)等，其中SOD起主要作用；植物体内抗氧化物质主要包括抗坏血酸、维生素及还原性谷胱甘肽等。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)，是一种催化超氧化物阴离子自由基发生歧化，生成氧和过氧化氢，从而清除超氧化物阴离子自由基并含有不同金属离子的氧化还原酶。SOD作为体内自由基的有效清除剂，能使自由基的形成和消除处于动态的平衡，从而抵御O2-的毒害作用[3]。该酶最早于1938年Mann和Keilin[4]在进行牛血红细胞的分级分离时，从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质，命名为血球铜蛋白(Erythrocuprein)，但其生理机能并未研究清楚。到1969年才由McCord和Fridovich[5]发现该蛋白具有生物酶活性，能催化超氧阴离子进行歧化反应，从而命名为超氧化物歧化酶[6]；直至目前，有关SOD的研究已涉及化学、生物、医药、日用化工、食品诸领域，对SOD的研究逐步深人、扩展。本文就超氧化物歧化酶的来源、种类和分布、结构和理化特性、SOD基因的克隆和表达、分离纯化、及制备开发应用等方面做一综述，旨在为其进一步研究、开发、应用提供参考。1SOD的分类和来源超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到的。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化氧自由基发生歧化反应的性质，因此正式将其命名为超氧化物歧化酶。迄今为止的研究表明[7]，SOD广泛存在于多种生物体内，已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内分离得到了SOD。1.1SOD的分类按金属辅基不同，SOD主要分为：①Cu/Zn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中；②Mn-SOD，主要存在于原核及真核细胞的线粒体中；③Fe-SOD，主要存在于原核细胞中，但也有人报道Fe-SOD存在于真核藻类及植物叶绿体基质中[8]。人体内的SOD主要有三种：①SOD-1(Cu/Zn-SOD)：主要存在于细胞质中；②SOD-2(Mn-SOD)：主要存在于线粒体中；③SOD-3(extracellularsuperoxidedismutase,EC-SOD)[9]：主要存在于细胞外基质和细胞表面上，是细胞外液如血浆、淋巴液、关节液及脑脊液中最主要的SOD同工酶，也是清除细胞外O2-的主要酶。但是，除了以上三种SOD外，有科学家最近又发现了两种新的SOD，一种是含镍酶即Ni-SOD，一种是含铁和锌的酶即Fe/Zn-SOD。它们均为四聚体，且它们之间没有免疫交叉反应。1.2SOD的来源1.2.1动物源SOD动物血(原多从牛血中提取)中SOD不仅含量丰富，且提取和纯化较方便成本低，红细胞膜易破，用常规分离纯化方法可获得高纯度的SOD[10]。经过采血、取血球、丙酮沉淀、热处理、透析、上柱、浓缩、冷冻干燥而成，可作为药用。1.2.2植物源SOD自1997年欧盟禁止使用动物提取SOD，从植物中提取SOD就成了一个很重要的来源。植物来源SOD为Cu/Zn-SOD，是从鲜叶茎中提取的一种极好的水溶性蛋白利于人体吸收[11]。该途径解决了从动物血液中提取的SOD存在病毒交叉感染的弊端。因此，从植物中提取的SOD安全性很高，避免了可能发生的交叉感染，且具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。1.2.3酶法生产SOD由于微生物发酵法生产SOD不受季节、气候和地域的限制，具有生产周期短、产量高、成本低、能大规模生产等特点，近年来得到了迅速的发展。菌种是发酵生产酶制剂的重要条件，可考虑筛选或选育能在极端条件下如嗜热、耐酸、耐碱、抗压等条件生长的SOD生产菌。必要时还可采取诱导手段，如用5-溴尿嘧啶诱导酵母SOD表达活性效果明显，可以在此基础上继续试验，以筛选酵母SOD高产菌株[12]。目前开发用于SOD发酵生产的菌种有酵母株Y-22，SIPI-215y，ZDF-48；嗜热栖热菌ATCC27634；嗜热脂肪芽孢杆菌BS211-15；SOD高产菌株BIT-8701等；另外，还有大肠埃希菌、乳酸杆菌等。2SOD的结构和性质2.1同类SOD在进化上的保守性及其结构上的同一性近10年来，通过对已完成的全部氨基酸序列分析结果的比较研究，发现不同来源的Cu/Zn-SOD在氨基酸序列上有较高同源性，且理化性质相似，而不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也有较高的aa同源性和相似的理化性质[13]，它们可能分别由两种原始酶进化而来，但是它们有明显的差异氨基酸以及对的敏感性[14]，同一类SOD不仅在进化上有高度的保守性，而且结构上也有高度的同一性。Fe-SOD和Mn-SOD在空间结构上与Cu/Zn-SOD不同，较高程度的α-螺旋而较少β-折叠。结合底物O2-的是一个椭圆形的“口袋”，为15×9×A。口袋外缘一边是由T135，G136，A138和G139组成，另一边则由G59，P60，H61及F62和N63组成。K134和R141的侧链组成口袋两侧。Cu，Zn和D81，H118，H44，H78，H69组成口袋底部。在这个活性中心，Cu与4个His的咪唑环N原于形成近四方平面的配位结构。Cu和Zn之间通过共同连接一个H61而形成“咪唑桥”。在Cu/Zn-SOD，Cu接近于溶剂，Zn被包埋于疏水内部。在Cu离子上还结合有1分子H2O，铜为5配位的铜。在Fe-SOD中，除His残基参与金属辅基的配位外，还有Trp残基与Fe形成配位。ESR和NMR研究揭示，Fe-SOD和Mn-SOD中的金属离子是处于高自旋态的Fe3+和Mn3+。天然SOD活性中心金属配位结构见图1，Cu/Zn—SOD酶活性中心结构见图2。2.2SOD的理化性质SOD的等电点偏酸性，为酸性蛋白，在酶分子上共价连接金属辅基，因此SOD对热、pH值和蛋白水解酶的稳定性比一般酶要高。三种SOD的主要理化性质见表1[15]。2.2.1SOD对氰化物和H2O2的敏感性所有的CuZn-SOD对氰化物敏感，只有1mmol/L-2mmol/L的氰化物浓度即使其活性完全丧失，而Mn-SOD和Fe-SOD却不被氰化物抑制。长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响。2.2.2SOD的吸收光谱特性CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280nm处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680nm左右，这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。2.2.3SOD稳定性及影响因素PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.3～9.6间催化性能良好，在pH4.5～pH11间能稳定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时，即使加热到95℃，其活性损失也很少。SOD在模拟胃酸和模拟胃肠道蛋白酶、胰蛋白酶环境中的稳定性研究表明，SOD在动物胃肠道中具一定的稳定性，在胃酸的环境中，37℃保温150min，活性仍残存81%，在胃蛋白酶和胰蛋白酶环境中，保温210min活性残存率分别为82%和84%[16]。其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定[17]。另外还发现有机溶剂和CL对SOD的活性具抑制作用[18]。2.2.4SOD的安全性大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。3SOD的作用机理和生理功能3.1SOD的作用机理近年来对SOD家族的深入研究表明，人Mn-SOD是一个由