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PET包装生产线无菌验证方案批准：审核：编制：1.目的及要求1.1本方案规定了PET设备无菌验证的必备程序。1.2本方案用于以下几种情况：1.2.1新安装PET线无菌验证时；1.2.2PET线大修后无菌验证时；1.2.3PET线与无菌环境相关联部位进行改造、更换时；1.2.4PET线出现严重质量问题需要重新验证时。1.3本方案包括S1－S7过程，只有在新PET线安装后无菌验证时需要全部完成，其余情况适用时可根据设备维修情况减少过程。1.4所有过程及结果必须记录，报告品控经理，并存档备查。2.实验前准备2.1无菌验证执行之前，需制定验证流程及时间进度表，并告知所有相关方。必要时需与外方工程师确认合同中规定的验证内容。验证前需对以下情况进行确认：2.1.1了解机器安装进度a.确认微生物方面内容b.微生物实验室内部确认c.微生物仪器确认（液体取样器，气体取样器，超净台，移液枪，振荡器等）2.1.2确认水处理参数，保证供水质量稳定（主要为硬度，微生物，电导率，pH等）2.1.3设备安装、大修完毕后,关注CIP/SIP/COP/SOP的运作，主要为化学品浓度（CIP，COP，SOP实验，连续三次化学品浓度稳定在范围之内），SIP温度参数确认，取样时间，顺序以及取样点要与生产、设备部门、外方共同确认。3.实验程序S1着色测试（如设备存在自动COP系统功能时）目的：验证灌装机内部清洗是否无死角共18页第2页进行着色测试前，运行COP/SOP，记录下喷头类型以及位置。a.对比以往SOP喷头与现时喷头位置b.通过图纸对比，来确认可能喷不到的点，以及关键区域的点，加以关注c.准备染色溶液，进行着色实验，并且准备电筒，纸巾，对可能着色不到的地方进行确认。染色溶液准备：52g可溶性淀粉（可用其它增稠剂替代），2g胭脂红（可用其它色素替代，数量可调整，以清晰着色为准），2L纯净水溶解，煮沸后待用。对微生物实验室中的杀菌锅，灌注系统，UHT系统（如有）的SIP温度，以及UHT保持管末端温度使用温度测试条进行验证。实验过程：用背负式喷雾器将灌装机内装有自动COP喷头的所有区域进行均匀喷雾着色，操作不方便的部位采用喷壶手动喷雾，确保所有区域均匀着色。之后启动设备自动COP过程，待设备自动COP结束后观察有颜色残留的地方。检查喷头位置，调整到最佳状态，再次进行着色试验。新线无菌验收时，请外方工程师将喷头调整到无着色残留为止。大修时，有颜色残留点作为手动泡沫清洗之重点，并以文件形式规定这些重点，专人验证。以上任务完成后，确认钢片位置，钢片位置必须包括着色残留点。S2贴片测试（当设备具备SOP功能设定时）目的：检验灌装机SOP效果事先准备材料：移液枪（如图一）（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把1-9ml）以及枪头各100个，细菌悬浊液（除特殊说明，本方案中所提到的细菌悬浊液全部使用枯草芽孢杆菌），钢片50片（如图二），钢片可以购买也可以自制，自制规格为长×宽×厚＝50×20×(1~2)mm，一端带孔，孔径为6mm。100ml塑料圆盒(洗脱液盒)50个，不锈钢托盘3个，锡箔纸5卷，平皿（塑料/玻璃均可），TSA培养基（胰酪胨大豆琼脂，枯草芽孢杆菌检测专用琼脂），3M胶带，扎带，针筒（1ml，10ml各一个），振荡器（如图三）（可选），摇床（可选），三角瓶以制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。接种环境：确定一间远离生产区域和实验室的房间作为接种室，内部有恒温设施，温度计，湿度计，生石灰（作为干燥剂），桌、椅各一张。出入此房间人员必须严格控制。钢片接种、空瓶、空盖接共18页第3页种全部要求在接种室进行。污染控制:凡是使接触或可能接触过菌种的地方都要进行消毒，尤其是生产车间内的灌装间，凡是接触过菌种的设备，工具，仪器表面必须进行高温灭菌或者相对应的处理。验证衣着：S2-S5验证都应当穿着无菌服，手套，进行全身杀菌的条件下进行。转移：移入生产车间前，样品需要事先用消毒过的铝箔或塑料袋密封保存，不能污染其他生产区域。试验相关要求：将样品按照验证程序要求，进行相应的处理，完毕后采用无菌取样的方式移出，进行微生物检验。操作前，按照要求进行洗手、更衣、消毒等人员卫生程序。不相关的人员严禁进入净化间，避免人为污染的存在。所用工具事先完成消毒处理。操作过程中产生的废弃包装物、废弃样品和防护用品等物品及时销毁，并对相关操作区域和接触过的区域进行彻底消毒处理。图一、移液枪图二、钢片图三、振荡器共18页第4页钢片接种：将菌种原液稀释进行梯度稀释（假设菌种浓度已给定，为1*10菌悬液），首先用无菌针筒，取1ml菌液，至9ml无菌水试管中，用振荡器混匀（此时菌种浓度为1*10），成为稀释液A，然后取稀释液A0.1ml至灭菌钢片上（此时菌种浓度为1*10），具体数量参照验证协议，室温干燥6-10小时（可以事先备好生石灰做干燥剂），（此时钢片上的菌种估计为1*10，干燥期间细菌材料处理：钢片用锡纸包裹，与培养基，无菌瓶一起杀菌，待用。接种前，先用振荡器，把菌种的悬浊液混匀。用无菌水制成规定浓度的细菌溶液备用。接种完毕之后，用不锈钢托盘，垫一层锡箔纸，把钢片接种面向上，整齐排列在锡箔纸覆盖的托盘之上，放置完毕之后，再用一层锡箔纸覆盖在托盘之上。9876数量可能减少一个数量级，请依照预实验情况，以及接种环境条件进行接种）。接种钢片50个，预留10片作对照，不放入灌装机，用于初始接菌量的检验。干燥后，用不锈钢托盘，用铝箔纸托底，将钢片接种面向上放置。钢片安置（如图四）：菌液干燥后，就可进行S2。接种后钢片使用塑料扎带或者双面胶，悬挂或黏贴在之前通过着色实验确认的点上，贴片点30－40个。安置钢片时，可由三人进行操作，一人在无菌环境内安置，其余两人则协助钢片安置，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。钢片安置完毕之后，关闭灌装机各个密封门，并且确认。之后进行SOP，期间由相关人员对灌装间SOP的实际时间进行确认。关于SOP参数，需事先取得，依照此数据试验。图四、1、贴片点：灌装机进甁星轮2、贴片点：旋盖头表面共18页第5页20分钟后，置于超净工作台上取出，进行梯度稀释，如按照0.5-0.9*10个/ml的初始接种量来算，首先钢片放入100ml洗脱液时，此时浓度菌液为0.5-1*10个/ml），再对菌液进行两次梯度稀释（每（次稀释需要对放置稀释液的试管进行振荡，使菌液混匀），制成稀释液B（此时浓度菌液为0.5-1*10再取1ml稀释液B进行一次梯度稀释，制成稀释液C（此时浓度菌液为0.5-1*10个/ml），取1ml稀再用0.1ml移液枪，取稀释液B此时浓度菌液为0.5-1*10个/ml）0.1ml加入9ml无菌水中，对其进即每个对照做10稀释，10稀释，0.1*10稀释各一次。对照钢片建议一共10组。通过试验得出（3、贴片点：灌装机出口星轮S2实验无菌流体取样点：从S2开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行无菌水微生物取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，以细菌总数以及霉菌/酵母温度培养，S2过程中还要进行百级区尘埃粒子检测、百级区浮游菌或沉降菌检测。对照钢片处理方法：S2中，SOP结束后，先处理对照的钢片，把钢片放入灭菌后的洗脱液中，注：洗脱液的制备：8.5gNaCL、0.1g吐温80溶解于1L纯净水中经121℃、30min灭菌后备用。）摇晃642个/ml），此时取1ml稀释液B进行膜过滤，（使用0.45白色无菌膜，使用TSA培养基，90mm大平板），如产生泡沫，使用无菌水加入滤杯助滤。1释液C进行膜过滤，（使用0.45白色无菌膜，使用TSA培养基，90mm大平板），如产生泡沫，使用无菌水加入滤杯助滤。2行膜过滤，（使用0.45白色无菌膜，使用TSA培养基，90mm大平板），如产生泡沫，使用9ml无菌水加入滤杯助滤。-4-5-4钢片原始菌数量。钢片卸载：卸载钢片时，可由三人进行操作，一人在无菌环境内卸载，其余两人则协助钢片卸载人，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。钢片背部以及边缘，需使用酒精或者PAA稀共18页第6页接种：10接种：从2*10吸1mL到9mL试管，稀释成2*10的菌悬液，然后从2*10吸2mL加入78mL无菌水中，稀释成5*10的菌悬液，用移液枪取1ml至刚吹好的PET空瓶内，拍打空瓶，使释等消毒液进行消毒，但是消毒液绝对不允许接触钢片正面，消毒完毕后，用9ml无菌水冲洗，并立即放入80ml洗脱液的塑料盒中，上下摇晃20分钟待用。实验方法：取下钢片后，把钢片放入已灭菌的洗脱液中，摇晃20分钟后，置于超净工作台上取出，直接对洗脱液进行膜过滤，如产生泡沫，使用100ml无菌水加入滤杯助滤，取下滤膜，放入事先准备好的培养基平板（90mm或者更大平皿，事先倾倒好无菌培养基）。实验后，平皿放入35±2℃培养箱，72小时后计数。S3瓶内接种试验目的：检验灌装机对PET瓶的杀菌效率事先准备材料：移液枪（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液，100ml塑料圆盒（洗脱液盒）150个，不锈钢托盘，锡箔纸，平皿（塑料/玻璃均可），TSA培养基（胰酪胨大豆琼脂，枯草芽孢杆菌检测专用琼脂），3M胶带，扎带，针筒（1ml，10ml各一个），振荡器（可选），摇床（可选），三角瓶制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。６9８８6菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/分布于空盖底部（如图五）。共接种200个空瓶，其中40个备用，空瓶室温干燥12-24小时（可以事先备好生石灰做干燥剂）。接种PET瓶安置：菌液干燥后，就可进行S3。接种后PET瓶（注：不能旋盖），使用塑料袋（或纸箱），将200个已接种的PET瓶，从接种室转移到注入间，挂上风道。按照规定最大灌装速度（例36000bph），进行验证。杀菌后PET瓶中注入100ml无菌水后封盖，从注入机出口运输带取出，转移至指定区域，剧烈晃动20分钟，然后做膜过滤试验，滤膜放入放入事先准备好的培养基平板（90mm或者更大平皿，事先倾倒好无菌培养基）。实验后，平皿放入35±2℃培养箱，72小时后计数。S3实验无菌流体取样点：从S3开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样，包括冲瓶/冲盖无菌水，冲瓶口无菌水的取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，分别选用PCA（platecountagar平板计数琼脂，GB/T4789.2-2008中菌落总数检测专用琼脂）/虎共18页第7页接种：10接种：将稀释至10菌悬液，用移液枪取1ml至空盖内，使菌悬液呈小水珠附着分布于红培养基，以总菌以及霉菌/酵母温度培养，如采用臭氧方式进行水杀菌，建议使用抗臭氧型培养基。S4盖子接种试验目的：检验盖杀菌机的杀菌效率事先准备材料：移液枪（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液，100ml塑料圆盒（洗脱液盒）150个，不锈钢托盘，锡箔纸，平皿（塑料/玻璃均可），TSA培养基，3M胶带，扎带，针筒（1ml，10ml各一个），振荡器，摇床，三角瓶制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。６6空盖底部，水珠越小越好（如图六）。盖子接种数量为80个，其中20个备用，空盖室温干燥2-4小时（可以事先备好生石灰做干燥剂），水珠完全挥发后使用。空盖安置：使用托盘铝箔纸，将接种好空盖覆盖好，转移至注入间。从下盖槽整齐排列。建议接种盖与洗盖槽中其他盖，以颜色区别或做标记。按照规定最大灌装速度（36000bph）进行验证。杀菌后瓶盖，旋盖于灌装100mL无菌水的瓶子上，从注入机出口运输带取出，转移至指定区域，剧烈晃动20分钟，然后做膜过滤试验，滤膜放入放入事先准备好的培养基平板（90mm或者更大平皿，事先倾倒好无菌培养基）。实验后，平皿放入35±2℃培养箱，72小时后计数。S4实验无菌流体取样点：从S4开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样，包括冲瓶/冲盖无菌水，冲瓶口无菌水的取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过