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PFGE分型技术和技术参数设置金东2010年6月PFGE原理及相关参数PFGE原理及相关参数超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度后DNA的迁移速度几乎与分子大小无关。当DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，卷曲的DNA分子在电场作用下会沿电场方向拉伸变形挤过筛孔，凝胶介质的分子筛效应不明显，此时DNA分子在电场中的迁移速度主要取决于电场强度。有实验证明长度大于40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离。PFGE原理及相关参数脉冲场凝胶电泳可以分离长至50MB的DNA分子。其原理是DNA分子在交替变换方向的电场中做出反应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶中移动也快，于是不同大小的分子被成功分离。DNA分子在交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场方向平行泳动前的重新定向解释。DNA分子以蠕行（reptation）方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁移。当电场变换方向时，DNA分子在新的方向泳动前必须再定向。所以，电场方向有规律地变换，DNA也必须有规律地改变泳动方向。分子越大重新定向需要的时间越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，最终达到了分离的目的。目前常用的脉冲场凝胶电泳仪器为箝位匀强电场系统（contour-clampedhomogeneouselectricfield,CHEF）方框代表琼脂糖凝胶，一排长方形小框代表DNA加样孔，六边形代表CHEF系统的电极（4X6）。当电泳工作时，DNA分子以箭头方向迁移。PFGE原理及相关参数影响分辨率的因素影响分辨率的因素包括：脉冲时间、电场夹角、电场强度、电影温度、缓冲液以及电泳时间等。在脉冲场凝胶电泳中通常包括脉冲时间、电场强度、温度、缓冲液组成、琼脂糖类型和浓度以及电场夹角等参数而只是改变脉冲时间来控制分辨样品的范围，即通过增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间来分离较小分子。脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。例如：脉冲时间为30s，即电场方向将会在30s变换一次。脉冲时间是脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范围值如：2－20S。这样是为了使一定范围内的DNA片段都可以得到理想的分离。这种脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换的；而非线性的变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使相应大小的片断得到更好的分离。脉冲时间脉冲时间—不同脉冲时间对带型的影响2.2-54.2s2-30s2-35s2-25s随着大脉冲时间的缩短大片段的位置也在逐渐靠近加样孔，同时小片段也有不错的分离效果。电场夹角使用较小的电场夹角可以分离较大的DNA片段，而大的电场夹角分离较小的片段。当使用较小的电场夹角时，小片段会变的相对集中。大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120度。120°100°105°96°94°电场角度随着电场角度的减少，两个大片段分的更开。但是同时小片段也在逐渐的压缩。所以为了兼顾不同大小的片段需要选择一个合适的电场角度。2.2Mb1.6Mb大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120。电场强度电场强度以V/cm来表示的。因为通常的CHEF型脉冲场凝胶电泳胶区的长度为33cm，所以200V的电压实际上为6V/cm。使用较高的电场强度可以分离较大的DNA片段，反之亦然。大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场强度为6V/cm。缓冲液类型脉冲场凝集电泳中的缓冲液选择需要考虑两方面的问题：缓冲液的缓冲能力以及长电泳时间中液体的损耗问题。通常用于脉冲场凝胶电泳的电泳缓冲液包括两种0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB级的DNA片断的分离（3MB），而0.5XTBE常用于1MB的片断的分离。电泳温度脉冲场凝胶电泳通过冷凝以及循环系统实现对电泳缓冲液的温度控制。当缓冲液的温度越高，电泳所需要的时间也就越短。但是，较高的温度会造成条带弥散，影响分辨率。通常使用的缓冲液的温度为12℃－15℃。在这个温度内可以最好的兼顾电泳时间和分辨率。琼脂的种类以及琼脂的浓度使用的琼脂糖浓度越低，所能分离的DNA片段越大。但是琼脂的浓度低，其机械强度也低，实验操作中的难度也会加大。在脉冲场凝胶电泳中使用的琼脂糖应当具备以下的特点：1、机械强度大，利于实验操作2、纯度高，高纯度的琼脂可提高电泳的分辨率3、熔点低，包埋细菌时凝胶的温度不易过高电泳时间电泳时间需要在分辨率和总的实验时间之间寻找一个平衡点。因为通常希望尽快完成实验，因此理论上说电泳的时间越短越好。但是短的电泳时间会降低实验的分辨率从而影响实验结果。在PulseNet标准操作中的电泳时间并不是固定的,其要求是标准菌种H9812中20Kb左右的片段达到胶的下沿1-1.5cm.基因组DNA的制备为防止大的DNA片段断裂，PFGE所用的样品是从琼脂糖包埋活细菌中制备的。预先细菌定量很重要，这是因为PFGE中的DNA的泳动相对于普通电泳对浓度的要求更高，过多的DNA会造成泳动异常减慢。以上是脉冲凝胶电泳的基本原理以及其影响因素，因为PFGE操作繁琐，其中影响因素很多，因此需要仔细严格操作。PFGE操作基本流程PFGE操作的基本流程—革兰氏阴性菌PFGE操作的基本流程相对于容易破壁的革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌通常需要使用溶菌酶或者是其他试剂对其进行预先处理。PFGE聚类分析原则TENOVER原则与聚类分析不同研究者对于同样的PFGE带型会有完全不同的解释，对于这些菌株是否属于暴发相关或者暴发不相关的菌株也会有完全不同的意见，对于PFGE带型上条带的差异也有不同的解释。TENOVER原则是在没有使用软件进行分析的时候PFGE带型解释方法。这个标准对于临床实验室分析一个小型的相关性较高的分离株（比较典型的菌株数小于等于30株）推断是否属于暴发更有意义。基本原则一般而言，引起大流行的病原体大都来自遗传结构相同或相近的生物。同源生物体是同种的不同个体，具有相同的毒力因子、生化特征和基因特性。然而，生物体在不同时间、不同来源、分离自不同地理区域，在种的层次仍存有其差异可分成亚型或基因型。在流行病监测方面，生物体分型对于感染性疾病大流行的辨识是相当重要的。例如监测院内病原菌的交叉感染、追踪传染来源和辨识具有高度毒力的生物体品系。菌株分型的目的是为了提供实验室角度的证据。这一证据支持那些分离自一次爆发中分离的流行相关的（epidemiologicallyrelated）菌株同时也是遗传相关的（geneticallyrelated）菌株，从而证明这些菌株是同样的菌株。在使用细菌分型的结果进行暴发研究时是基于以下几个假设的：1.属于一次暴发的分离株来源于同一个祖先2.这些菌株应该具有相同的基因型3.流行病学无关的菌株应该有不同的基因型别实际上某些流行病学无关的菌株同样会有相同或者相似的基因型。例如大部分的耐青霉素的金葡菌来源于少数几个祖先。所以一次暴发的菌株可能很难与本来存在的院内感染的金葡菌区分。基本原则基因事件与条带变化无法区分：分离株有相同的带型，包括条带的数目和位置。这些分离株为同一菌株。高度相关：如果PFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化，这些菌株就被定义为高度相关菌株。这些仅有两到三个条带变化的情况常见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株。可能相关：PFGE带型与爆发菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条带变化。（通常是4到6个条带的变化）。这些分离株可能是遗传上相关的，但是并不是紧密相关的，其流行病学关系也并不紧密。这样的突变常见于分离自较长的时间段（大于等于6个月）或者是大规模延伸爆发的病人中。无关：三个独立的基因事件引起的条带变化（7个或者是以上的条带变化）。TENOVER原则TENOVER原则的聚类方法首先，检查所有的带型看看能否发现一个暴发带型或者是代表带型。如果没有发现代表带型那么这些分离株很可能是流行病学无关菌株。（流行相关的菌株中没有代表带型的情况是小概率事件）。其次，以暴发带型为基础和其他分离株的带型进行比较。每个带型应该确定与暴发带型关系。带型差异超过50%的分离株可以认为是暴发无关分离株。而那些与暴发带型只有2到3个条带差异的分离株被认为是暴发带型的衍生。TENOVER原则的问题PFGE图谱上的一个条带就一定是单一条带吗？TENOVER原则的问题•如果基因事件发生在凝胶之外的片段？•质粒对图谱是否会产生影响？•图谱中的条带数目相同但是位置上有差异？只有带型相似性在100%的菌株才可能是暴发菌株。聚类分析聚类分析仅从细菌分型研究角度来说，我们只能在有不同的型别的时候证明两株菌是不同的；而不能说某两株菌是相同的，尽管这两株菌可能使用多种分型方法后都有一致的结果。如果没有流行病学资料分型研究就可能会导致错误的信息。菌株分型研究不能代替流行病学研究。两项工作应该分别进行但是要综合在一起进行分析才能确定是否真正存在着暴发。PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法，然而一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月，分型研究就转化为种群研究。而另外一些技术，如MLST，主要用于监测微生物种群随时间的变化。管家基因的突变是中性突变，不受环境选择压力的影响。近来，这两种方法经常被结合起来用于细菌的分型研究。这两种方法的结合使用所获得的信息，有助于我们弄清楚暴发菌株是如何扩散的，以及各细菌种群是如何时间的变化的。谢谢！