环境抗生素抗性基因研究进展-苏建强

生物多样性2013,21(4):481–487Doi:10.3724/SP.J.1003.2013.07071BiodiversityScience——————————————————收稿日期:2013-03-22;接受日期:2013-06-08;基金项目:国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目(21210008)和国家国际科技合作专项(2011DFB91710)∗通讯作者Authorforcorrespondence.E-mail:[e-mail]环境抗生素抗性基因研究进展苏建强黄福义朱永官*(中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室,福建厦门361021)摘要:抗生素耐药性及其在全球范围内的传播已成为国际关注的热点。本文结合最新文献,综述了抗生素抗性基因在环境中的来源、传播、分布以及新型抗性基因的发现等方面的研究进展。环境中抗生素抗性基因的来源主要是环境中细菌的内在抗性基因及随人或动物粪便排到体外的抗性细菌。功能宏基因组学技术的应用极大地丰富了人们对抗生素抗性组学的认知,并已从环境中筛选到多种新型抗性基因。近年来,由于抗生素在医疗以及养殖业中的大量使用,增加了抗性基因在环境中的丰度和多样性,加速了抗性基因在环境中的传播,在多种环境介质(如养殖水域、污水处理厂、河流、沉积物和土壤等)均检测到多种高丰度的抗生素抗性基因。我们建议今后在以下方面开展深入研究:(1)抗性基因传播和扩散的机制;(2)新型抗性基因筛选和抗性机制;(3)抗生素和抗性基因环境风险评估体系等。关键词:抗生素,抗性基因,抗性组学,高通量荧光定量PCRAntibioticresistancegenesintheenvironmentJianqiangSu,FuyiHuang,YongguanZhu*KeyLaboratoryofUrbanEnvironmentandHealth,InstituteofUrbanEnvironment,ChineseAcademyofSciences,Xia-men,Fujian361021Abstract:Antibioticresistanceanditsspreadinbacteriaaretopicsofgreatimportanceinglobalresearch.Inthispaper,wereviewrecentprogressinunderstandingsources,dissemination,distributionanddiscoveryofnovelantibioticsresistancegenes(ARGs)intheenvironment.Bacteriaexhibitingintrinsicresistanceandan-tibioticresistantbacteriainfecesfromhumansandanimalsarethemajorsourcesofARGsoccurringintheenvironment.AvarietyofnovelARGshavebeendiscoveredusingfunctionalmetagenomics.Recently,thelong-termoveruseofantiboticsindrugtherapyandanimalhusbandryhasledtoanincreaseindiversityandabundanceofARGs,causingtheenvironmentaldisseminationofARGsinaquaticwater,sewagetreatmentplants,rivers,sedimentandsoil.FutureresearchshouldfocusondisseminationmechanismsofARGs,thediscoveryofnovelARGsandtheirresistantmechanisms,andtheestablishmentofenvironmentalriskas-sessmentsystemsforARGs.Keywords:antibiotics,antibioticsresistancegenes,antibioticresistome,high-throughputquantitativePCR作为20世纪最重要的医学发现之一,抗生素自被发现以来,已拯救了无数的生命,为人类传染病的防治做出了重要贡献。抗生素除了应用于医疗领域之外,由于其预防疾病和刺激生长的作用,常以亚治疗剂量长期添加于饲料中,在全球范围内广泛应用于养殖业中(Chee-Sanfordetal.,2009;Panetal.,2011;Hvistendahletal.,2012;Qiaoetal.,2012)。摄入人体或动物体内的抗生素大多未能被充分吸收和代谢,而通过排泄物进入环境,人为增加了对环境中微生物群落的进化选择压力。近年来,随着一些医疗保健药品和个人护理用品的频繁使用以及养殖业中抗生素的长期滥用,导致大量具有耐药性的细菌出现。这些抗性细菌在数量、多样性以及抗性强度上都显著增加,许多菌株具有多重耐药482生物多样性BiodiversityScience第21卷性,甚至出现了能耐受大多数抗生素的“超级细菌”。2011年德国爆发了“毒黄瓜”事件,疫情短期内在欧洲至少9个国家蔓延,33人确认死亡,超过3,000人受感染,包括至少470人出现肾功能衰竭并发症。引起本次疫情的O104:H4血清型肠出血性大肠杆菌是一种新型高传染性有毒菌株,该菌株携带氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类等抗生素的耐药基因,导致抗生素治疗无效。2011年世界卫生日的主题“抵御耐药性——今天不采取行动,明天就无药可用”,就是号召要遏制抗菌素耐药性的蔓延。近年来虽然新型抗生素的发现和开发速度持续下降,但相关的抗生素抗性基因(AntibioticResistanceGenes,ARGs)却快速出现和扩散,极大地影响了抗生素的治疗效果,严重威胁人类健康。Pruden等(2006)提出将抗生素抗性基因作为一种新型的环境污染物。与传统的化学污染物不同,抗生素抗性基因由于其固有的生物学特性,例如可在不同细菌间转移和传播甚至是自我扩增,可表现出独特的环境行为。在医疗领域,对抗生素抗性细菌及抗性基因已有较为系统的研究,对各类已知抗性基因的分子机制已有较为清晰的认知,主要包括以下几类:(1)通过对抗生素的降解或取代活性基团,改变抗生素的结构,使抗生素失活;(2)通过对抗生素靶位的修饰使抗生素无法与之结合而表现出抗性;(3)通过特异或通用的抗生素外排泵将抗生素排出细胞外,降低胞内抗生素浓度而表现出抗性;(4)其他抗性机制包括在细胞膜上形成多糖类的屏障减少抗生素进入细胞内(Alekshun&Levy,2007)。近年来人们逐渐意识到抗生素抗性基因在环境中的持久性残留、传播和扩散比抗生素本身的危害还要大,抗生素抗性基因的研究在环境科学研究领域也日益受到关注,我国科学家建议尽快从国家层面上系统进行抗生素抗性基因的环境污染机理与控制对策研究(周启星等,2007;罗义和周启星,2008)。本文结合最新文献,综述抗生素抗性基因在环境中的来源、传播、分布、新型抗性基因的发现等方面的研究进展,并对今后的研究重点和方向提出了建议和展望。1环境中抗生素抗性基因的来源1.1内在抗性环境中细菌的“内在抗性”(intrinsicresistance)是环境中抗性基因的重要来源。内在抗性是指存在于细菌的基因组上的抗性基因的原型、准抗性基因或平时没有表达的抗性基因(Davies&Davies,2010),细菌可通过随机突变或表达潜在抗性基因而获得抗性。在自然环境中的抗生素浓度通常低于临床使用的浓度。环境中这些低浓度抗生素均可作为微生物种群间或种群内的信号分子,使微生物群落中的各微生物种群产生表型和基因型上的适应性反应(Aminov,2009),因此这些微生物种群普遍存在内在抗性基因。多数天然抗生素来源于土壤微生物,因此土壤中必然存在着相应的抗性基因。D’Costa等(2011)从北极3万年的冻土中提取到来自于晚更新世生物的DNA,发现存在多样性很高的抗性基因,这些抗性基因对β-内酰胺类、四环素类和糖肽类等抗生素具有抗性。进一步的研究发现其中万古霉素抗性蛋白的结构和功能与现代的变体极为相似(图1),这表明一些类型的抗生素的抗性基因早就存在于自然界中,而并非是由于现代临床治疗过程中抗生素的使用而造成。Allen等(2009)从基本不受人类活动干扰的阿拉斯加冻土中筛选到多种新型的β内酰胺酶基因,并首次发现了双功能的β内酰胺酶基因。随后Lang等(2010)从相同样品中筛选到新的氯霉素类抗性基因,表明抗生素抗性基因同样存在于远离人类活动的地区。随着高通量测序技术的发展,通过对多种细菌基因组和环境宏基因组的测序,人们发现环境中存在着大量的潜在抗性基因以及与抗性基因水平转移相关的基因元件(Gillingsetal.,2008;Fiereretal.,2012)。由于抗生素是抗性基因的选择压力,随着环境抗生素污染的加剧,可能加速了细菌抗性基因突变和抗性基因水平转移,这些抗性基因一旦形成,可能通过基因水平转移进入人类致病菌内,从而危害人类健康(Telloetal.,2012)。1.2外源输入抗性细菌通过人或动物粪便随着肠道细菌排出体外,是环境中抗生素抗性基因的重要来源之一。最开始,大多数抗生素主要是用于人体防治细菌感染,因此多数抗性细菌最早也是在人体内被发现,它们随着粪便排泄出体外,进入医疗废水和生活废水中,并排放到环境中,而其携带的抗性基因即可通过水平转移传播到各种环境土著菌中。因此,在医疗废水中抗性基因的检出率较高,并常有多重第4期苏建强等:环境抗生素抗性基因研究进展483图1古老的万古霉素抗性基因。A、B:VanAA2结构。C、D:古代和现代VanA单体结构的比较(D'Costaetal.,2011)。Fig.1Ancientvancomycinresistancegenes.A&B,VanAA2structure.C&D,ComparisonofmodernandancientVanAmonomerstructures(D'Costaetal.,2011).耐药菌株检出(Websteretal.,2004;Jakobsenetal.,2008)。在我国,医疗废水经医院内部的设施处理后达标排放或经简单处理后直接汇入市政污水管道,最终进入城市污水处理厂作进一步处理。但是,抗生素在污水处理过程中很难被消除(Michaeletal.,2012),城市污水处理厂产生的含有抗生素和抗生素抗性的微生物随水体进入了环境中。此外,污水厂产生的污泥经填埋、露天堆放或堆肥农用后,抗生素抗性基因也随着污泥进入周围环境和土壤环境中。在动物养殖业中,抗生素的使用极大地刺激了抗性基因的发展。动物肠道内和粪便中含有丰富的抗性细菌和抗性基因,这样的粪便用作肥料后增加了农田土壤中抗性基因的丰度(Heueretal.,2011)。水产养殖业中,动物粪便直接排放到水环境中,使得水产养殖场频繁检测出抗性基因,包括磺胺类和四环素类抗性基因,且四环素抗性基因tet(E)存在于可转移的质粒上,增加了其自身的迁移传播能力(Agersøetal.,2007;PhuongHoaetal.,2008)。养殖和畜牧业废水中抗性基因的种类和浓度均较高,甚至在饮用水和循环废水中均能检测到四环素和磺胺类抗性基因,这些抗性基因可能对人类健康造成潜在的危害(Prudenetal.,2006)。动物粪便施肥是动物体内的抗性基因进入土壤环境的主要途径,在施用猪粪的农田土壤中可检测到高水平的抗性基因和抗性质粒(Knappetal.,2010),并可分离筛选到大量有较强抗性的菌株(Popowskaetal.,2012)。在中国3个城市的猪场附近土壤中,检测到了15种四环