TLR4的基因多态性与脓毒症的相关研究进展

复旦大学附属中山医院上海市枫林路180号200032*通讯作者：缪长虹[e-mail]4的基因多态性与脓毒症的相关研究进展缪长虹*焦静(复旦大学附属中山医院麻醉科，200032)摘要：脓毒症是指机体感染微生物后发生的全身炎性反应综合征。在该疾病发生发展中是基因多态性影响着机体对该综合征的遗传易感性。其中TLR4作为识别病原微生物的主要受体之一，在自身免疫中起着重要的作用。已有研究表明TLR4的基因多态性与脓毒症的遗传易感性密切相关，其中TLR4基因的Asp299Gly和Thr399Ile位点的突变与脓毒症的发生发展及预后有关。本文就TLR4的功能、信号转导通路及其基因多态性与脓毒症的相关关系作一综述。关键词：Toll样受体-4（Toll-likereceptor4，TLR4）脓毒症基因多态性脓毒症是指病原微生物感染机体后发生的全身炎性反应综合征。机体通过天然免疫系统识别病原体微生物，从而启动保护性炎症反应清除病原微生物。当机体系统性炎症反应过度时可导致脓毒症或感染性休克。目前降低脓毒症的死亡率仍然是ICU中难以突破的难题，而随之而来的多脏器功能障碍和脓毒性休克是ICU中最主要的死亡原因之一。严重脓毒症、感染性休克及由此导致的靶器官损伤和多脏器功能障碍每年有成千上万患者，其中1/4甚至更多患者死亡，死亡率并非随医疗条件和医疗技术的进步而下降，反而不断升高【1】。究其原因，一方面严重脓毒症发病第一时间治疗的及时程度、具体措施和救治目标,国内外和各地水平参差不齐，另一方面对脓毒症的治疗和最新指南如2008年拯救脓毒症运动（Survivingsepsiscampaign,SSC）【2】并未将基因多态性考虑在内，而实际上基因多态性是决定人体对脓毒症这一应激打击易感性和耐受性差异的重要因素。目前，国内外越来越多研究者将视线聚焦在免疫反应通路中关键基因的多态性变化，并探索它们之间的关系。在这条通路中因TLRs在自身免疫中起着重要的作用，而作为识别病原体相关分子模式受体的TLR4占着及其重要的地位。TLR4及其信号通路机体的天然免疫系统依赖一些模式识别受体（patternrecognitionreceptors,PPRS）来检测到细菌、病毒、真菌、原虫等病原微生物上的保守结构，这种方式称为病原体相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)【3】。Toll蛋白样受体（TLR）就是这样一群主要的模式识别受体，通过病原体相关分子模式（PAMP）识别病原微生物，激活并启动细胞内信号转导通路，诱导天然免疫的产生。因此它参与了许多疾病的发病过程，与传染病、肿瘤、心血管病、自身免疫性疾病、过敏等都有着密切关系。人体的TLR家族中至少有11个成员(TLR1-11)，其中TLR4是此家族中最早发现的成员之一，最早由1997年Medzhitov【4】等人发现并报道的。TLR4是一种与果蝇toll蛋白同源的跨膜蛋白，由富亮氨酸重复序列（leucine-rich-repeat,LRR）的胞外区、跨膜区和与人类白介素受体-1同源的胞内区组成，主要分布在单核细胞等细胞表面。TLR4也被认为是最重要的模式识别受体之一，主要识别革兰氏阴性细菌的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、真菌的甘露聚糖、结核分支杆菌的可溶性组分，以及是一些热休克蛋白和纤维结合蛋白的内源性配体。当细菌入血崩解释放内毒素后，其主要成分细胞壁脂多糖（LPS）与LPS结合蛋白（LPS-bindingprotein,LBP）结合，然后通过CD14传递给TLR4/MD2复合体，进一步诱导下游的信号转导。所形成的LPS-TLR4-MD2复合体的晶体结构模型已经被KimHM等人证实【5】。TLR4分别通过髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)和Toll白介素受体（TRIF）介导的两条信号传导通路，最后激活核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB）和活化蛋白-1(activatingprotein-1，AP-1)以及干扰素调节因子-3（interferonregulatoryfactor3,IRF3）易位进入细胞核，参与调节TNF-a，IL-1,IL-6等促炎症细胞因子和INF-α、β的转录及干扰素诱导基因的表达，从而激发机体级联炎性反应【6,7,8】。TLR4的基因多态性每个机体遗传学特点决定了个体对病原微生物刺激后引起的免疫反应千差万别，其中也包括脓毒症的病理生理变化，越来越多的证据表明基因的多态性是决定人体对脓毒症这一应激打击的易感性和耐受性差异的重要因素。1998年Potorak【9,10】等人研究发现，携带C3H/HeJ和C57BL/10ScCr基因的两株小鼠本身表现为对内毒素低反应性和对革兰阴性菌高度易感性,当时认为是一种假设的LPS基因突变选择性的阻碍了LPS信号转导，但同时在C3H/HeJ小鼠上发现TLR4基因第三外显子上存在错义突变，其基因编码的多肽链第712位的脯氨酸被组氨酸代替，从而证实是TLR4参与LPS的识别和跨膜信号转导，使人体对革兰氏阴性菌脓毒症的易感性增加。进一步研究【11】又发现TLR4基因敲除的小鼠其巨噬细胞和B细胞对LPS无反应，其对LPS的低反应性与C3H/HeJ小鼠相似，进一步证明了TLR4基因是调节LPS反应的关键。在众多的基因组学研究方法中，最常见的研究是单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）研究，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它也是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP现象从遗传学角度解释了为什么特定的疾病在不同个体间存在不同的易感性，如微生物感染。目前对TLR4研究最多的SNP是Asp299Gly和Thr399Ile两个位点的突变。这两种非同义基因多态性均位于TLR4转录起始处第三外显子上即编码LRR的区域，一种SNP是位于第896位点的A/G碱基转换使翻译的氨基酸序列第299位置的天门冬氨酸转变为甘氨酸，而另一种SNP是位于1196位的C/T碱基转换，使位于399的苏氨酸变为异亮氨酸。但由于这两个位点是共分离突变，就出现了Asp299Gly/wt,Thr399Ile/wt,Asp299Gly/Thr399Ile和wt/wt四种单倍型【12】。据Smirnoval等人【12】统计，由于地域和人种的差别，欧洲人种多为Asp299Gly/Thr399Ile单倍型，Asp299Gly单倍型在非洲人中出现频率更高，而在亚洲人中这两种突变均极为罕见，至于Thr399Ile单倍型本身就非常稀少。这也印证了大部分研究中出现这两处基因突变的人群都为白种人或非洲人，而在日本人、韩国人及中国人中都没有发现这两处单核甘酸多态性【13，14，15，16】。但没有发现是否与样本量太小有关目前尚不清楚。TLR4基因多态性与脓毒症易感性TLR4的基因多态性特别是位于第三外显子上的这两处SNP可导致TLR4细胞外结构的改变影响与病原体配体的结合，特别是与革兰氏阴性菌的LPS结合，其他还包括真菌和病毒，从而使脓毒症的病情进展和转归发生变化。最初由Arbour等人【17】通过转染TH-1细胞发现由于Asp299Gly位点的突变（而非Thr399Ile的突变）干扰了TLR4介导的LPS信号转导通路使呼吸道上皮细胞对吸入LPS的刺激反应性降低。其后Agnese等人【18】研究发现Asp299Gly/Thr399Ile突变明显增加革兰氏阴性菌感染的发生率。而Lorenz等人【19】研究显示Asp299Gly的突变减弱了机体对革兰氏阴性菌感染的免疫反应，从而导致机体对革兰氏阴性菌引起的感染性休克的易感性增加。Henckaerts等人【20】对774名ICU患者研究发现，携带NOD2/TLR4联合位点突变与菌血症的发生相关，且增加住院死亡率。而在对TLR4基因多态性与真菌感染的关系研究中，VanderGraaf等人【21】发现Asp299Gly/Thr399Ile的基因多态性增加了机体对白色念珠菌血行感染的易感性。Bochud等人【22】对接受造血干细胞移植的336位患者研究发现，供体携带A299G/T399I两种SNP的TLR4单倍体S4型增加受体获得侵袭性曲霉菌的危险性，且这种相关性主要发生在非近亲移植中。TLR4基因多态性除了与不同病原体引起的脓毒症易感性相关外，在外伤后发生的脓毒症易感性也相关。分别有研究【23，24】显示在烧伤患者中TLR4的Asp299Gly突变增加了其发生严重脓毒症的危险性。Shalhub等人【25】认为TLR4基因的突变与创伤后脓毒症的严重性相关，但是也认为这种危险性的增加可能不仅仅是由Asp299Gly单核甘酸多态性引起的，而与TLR4其他位点的突变协同引起。虽然有不少研究显示TLR4的基因多态性与脓毒症的发生发展有明显相关，但是仍然有一些研究得出阴性结果。Jessen等人【26】研究显示，TLR4的基因多态性与革兰氏阴性菌引起的脓毒症无明显相关性。Feterowski等人【27】在对多种微生物感染引起的术后脓毒症的研究中发现，脓毒症的发生率和死亡率与TLR4位点的突变没有相关性，且在多种微生物感染诱发的脓毒性腹膜炎小鼠模型中，TLR4缺损也没有影响机体细胞因子的释放及器官损伤的进展。在机体给予低剂量内毒素的研究中也多为阴性结果。Kumpf等人【28】在术前或术后给予LPS50pg/ml刺激，TLR4的Asp299Gly/Thr399Ile突变不影响炎症细胞因子的释放。Taudorf等人【29】给予200个健康男性静脉注射低剂量大肠杆菌内毒素后认为Asp299Gly与Thr399Ile的突变与细胞因子的变化无明显关系。Calvano等人【30】静脉给予低剂量LPS2ng/ml后引起的中度全身性炎症反应与TLR4的单核甘酸多态性无明显相关。正如此，进一步研究及探索其两者关系及参与因素不仅有重要的临床价值，而且理论上也有重要意义。展望目前对TLR4的基因多态性研究大多局限在Asp299Gly和Thr399Ile上，由于地域人种的差别，中国人群中携带这一突变的基因频率可能极低。SNP可以存在与外显子上，导致氨基酸序列的改变，从而改变蛋白质结构和功能，产生不同的表型。但是更多的SNP存在于内含子上，它们并不直接改变蛋白质的氨基酸序列，而是通过更多更复杂的机制对基因的复制、转录和翻译进行调控，从而形成不同的表型。因此很可能在TLR4中仍然存在其他位点的基因多态性，与脓毒症易感性相关，与脓毒症病情严重程度、预后和转归之间的存在内在联系。因此通过对TLR4基因多态性的探索为进一步了解人体对严重的损伤及感染所启动的免疫反应提供了遗传学及分子病原学证据。因此从TLR4基因多态性与LPS结合这一脓毒症发病起始源头，尽快尽早制定针对携带脓毒症易感基因患者的防治方案，可能是未来脓毒症治疗突破的方向之一，而抑制TLR4表达或应用其抑制剂可以减轻由细菌感染所致的系统性炎症反应，目前正在研究进行治疗探索，它亦是研究和开发新药的一个新的靶点，目前也已受到国际医学生物学广泛关注。参考文献[1]DombrovskiyVY,MartinAA,SunderramJ,etal.RapidincreaseinhospitalizationandmortalityratesforseveresepsisintheUnitedStates:Atrendanalysisfrom1993to2003.CritCareMed,2007,35(5):1244-1250.[2]DellingerRP,LevyMM,CarletJM,etal.Survivingsepsiscampaign:Internationalguidelinesformanagementofseveresepsisandsepticshock.CritCareM