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topha与cufflinks的处理流程第一个推荐：今天一个同学给我推荐一篇NatureProtocol上文章，关于转录组差异表达分析。尚在正式通读之前习惯性浏览一遍图表，说实在这篇文章着实让我觉得有点“另类”。这是一篇活生生的利用Bowtie、tophat和Cufflinks做转录组差异表达分析的protocol。里面详细讲解每一步需要分析什么，用哪些些软件，已经相关命令和参数。根据文章介绍的workflow，做转录组分析，无论是链特异性转录组数据（Strand-specificRNA-seq）还是非特异性数据，主要内容包括下面几个部分：1）readsmapping，这里面推荐两款软件一个是Bowtie，另一个是tophat（此软件相对于Bowtie或者bwa，可以识别转录本的可变剪接）2）转录组本组装（利用Cufflinks），转录本与已有基因组注释比较（利用Cuffcompare）、合并（利用Cuffmerge），转录组本差异表达分析（利用Cuffdiff）。下面附上原文中的两张图片供大家快速预览转录组分析大致过程，其中图1是转录组分析中可能会用到的软件以及相关功能，图2：是转录本分析的一般流程。图1图2关于转录组分析的相关软件在分析数据过程中的命令和参数，这里就不附加上来了，请大家直接阅读原文。第二个推荐：在转录组高通量测序数据分析过程中，主要就是转录本的构建（拼接）及表达水平的衡量，其次还包括可变剪接之类的转录后修饰等研究分析。因此，做过RNA-seq转录组测序数据分析的童鞋们一定使用过或至少听说过Cufflinks这个软件。Cufflinks是加利福尼亚大学伯克利分校数学和计算机生物实验室，由LiorPachter领导的StevenSalzberg’s团队，和马里兰大学生物信息和计算机生物中心的StevenSalzberg小组，以及加州理工学院的BarbaraWold实验室联合作用的结果。Cufflinks利用Tophat比对的结果（alignments）来组装转录本，估计这些转录本的丰度，并且检测样本间的差异表达及可变剪接。这个软件其实是个套装，包括四个部分分别命名为：cufflinks、cuffcompare、cuffmerge及cuffdiff。tophat--Cufflinks--cuffdiff转录组分析大致流程如下：第一步，利用tophat/bowtie比对结果（bam格式）及参考基因组构建转录本，最终的转录本是以gtf格式保存的。第二步，Cuffcompare主要是对两个或多个转录本集合中转录本相似情况的比较，例如将第一步构建出的转录本与ENSEMBL数据库中的转录本进行比较，评估转录本构建情况，此外，根据构建的转录本与已知ENSEMBL数据库中的转录本的相对位置定义了一系列分类，例如内含子区域、反义、基因间区域转录本等等近10种分类。第三步，cuffmerge是将多个转录本集合合并成一套转录本集合，例如将在多个组织样本中构建的多套转录本合并成一套转录本，cuffmerge能够很好地完成去除冗余。第四步，cuffdiff衡量两个或多个样本间差异表达的基因，例如癌症与正常组织间差异表达的转录本，此外还能衡量差异可变剪接体。至此，转录本测序常规数据分析基本结束，接下来进行实验验证或深入数据分析。OK，如果对cufflinks的流程理解没问题的话，现在问题来了！！在tophat--cufflinks--cuffdiff流程中，第一步对每一个样本会产生一个的gtf格式的转录本，因此若有n个样本就会有n个gtf.但是在对n个样本之间做差异表达分析时，由于各样本之间的转录本集合不相同。在做cuffdiff时，却要求输入一个gtf，以便对该gtf文件中转录本在不同样本间进行差异分析。因此需要将n个样本的gtf文件合并成一个。问题是，cufflinks有cuffcompare和cuffmerge两个合并转录本的方法，这是应该选用那个？这两个有什么区别？个人理解及经验分享：这是所有初做NGS分析的很因惑的问题，事实上，对于多个样本构建的多套转录本，如何得到统一的一套转录本，有下面三种方法：1在转录本拼接之前，把各样本的比对bam文件合并，然后用合并的bam跑cufflinks2每个样本的比对bam文件分别单独跑cufflinks，各样本的转录本构建后，再用cuffcompare合并为一套转录本。3每个样本的比对bam文件分别单独跑cufflinks，各样本的转录本构建后，再用cuffmerge合并为一套转录本。这三种做法区别在于：第一种方法流程相对简单，所有的工作都抛给cufflinks一人完成，你都不需要知道cuffmerge、cuffcompare的用法。貌似是种完美解决方案。但很大的问题是：cufflinks能处理得了最终合并的bam吗？对于小物种的样本还可以，但对于人，若是7，8个样本合成的bam，cufflinks吃不销！第二和三种方法是类似的，都是在保留可变剪切结构的前提下，将转录本合并。不同的是，cuffcompare只有A、B两条转录本结构相同的时候，才将A、B合并。而cuffmerge是A、B某些部分互相overlap，就将它俩合并。事实上，cuffmerge再做合并的时候，是把overlap的transfrag重新调用了cufflinks，合成一个transfrag。第二和三种方法还有一个很大的不同是，cuffmerge可以带上参考注释有参考的进行合并，而cuffcompare不能如此。这是cuffmerge对cuffcompare的一个优势。因此，我认为第三种方法比第二种方法是最接近于第一种方法，而第一种方法的可实现性较差，在现有条件，最完美的解决方案就是第三种方法：每个bam单独跑cufflinks，跑完的结果再用cuffmerge合并。相关的参考文献：