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国外学者发现胸苷酸合成酶(TS)是5-FU产生耐药的一个重要酶，癌组织中TS的表达水平可以用于指导治疗并与患者的预后相关，TS高表达患者对5-FU的敏感性明显高于低表达者，TS低表达容易对5-FU产生耐药性。胸苷磷酸化酶(Thymidinephosphorylase，TP)、胸苷酸合成酶(Thymidylatesynthase，TS)和二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)是细胞核酸代谢过程中起重要作用的三个酶，并且以不同的角度与5-FU相互作用而影响5-FU的疗效。TP可逆性地催化胸腺嘧啶核苷转变为2-脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶，即通过催化胸苷和胸腺嘧啶的相互转化而稳定细胞内胸苷的水平。进入体内的5-FU需经过TP的作用被活化后才具有抗癌作用，TP还具有血管生成活性，与PD-ECGF是同一基因的转录产物。TS是合成胸苷酸的限速酶，催化dUMP转化为dTMP，而dTMP是DNA合成和修复所必须的胸腺嘧啶核苷酸的唯一来源，所以TS在细胞增生过程中发挥重要作用。TS也被证明是5-FU作用的靶向酶，5-FU就是通过抑制TS活性阻断DNA合成而发挥抗肿瘤的作用。DPD是尿嘧啶和胸腺嘧啶分解过程中的第一限速酶，可降低用于DNA合成的尿嘧啶和胸腺嘧啶的水平而影响DNA的合成。DPD同时也是降解5-Fu的最主要的限速酶，体内5一FU用量的85%由此酶降解。...胸苷酸合成酶对结肠癌5－Fu化疗耐药影响的前瞻性研究【摘要】目的探讨结肠癌对产生耐药的机理,从细胞培养水平上进一步论证胸苷酸合成酶对化疗产生耐药的影响。方法应用MTT法对体外培养的30例结肠癌细胞进行药敏试验，再应用SP免疫组化法对30例结肠癌进行胸苷酸合成酶检测，然后将两个结果进行比较。结果胸苷酸合成酶高表达组体外培养的结肠癌细胞对的敏感性明显低于TS低表达组。结论胸苷酸合成酶表达程度的高低对临床结肠癌患者化疗药物的选择有一定的指导意义。【关键词】结肠癌;MTT;免疫组织化学;胸苷酸合成酶（TS）细胞培养ProspectiveStudyCHENXin,LDepartmentofPathology,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001,China;Nan'anHospitalofFujianProvince；1stHospitalofZhaoancityAbstract：ObjectiveprovedeeplytheinfluenceofTSincoloncarcinomawiththelevelofcellculture.MethodsstainingandobservedtheexpressionofTS;andthencomparewiththem.ResultsInvitroThepositiveexpressionofTShasainstructionsignificanceincoloncarcinomapatientsattheelectionofchemistrydrug.Keywords：Coloncarcinoma;MTT；Immunohistochemical;Thymidylatesynthase(TS);0引言广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切一直处于其他化疗药无法替代的地位，目前仍是肠道恶性肿瘤的首选化疗药。但一些结肠癌病例对为主的化疗并不敏感，为提高对原发性和继发性耐药患者的治疗效果，有必要从细胞水平上阐明耐药机制，找出能用于评价化疗敏感性的指标。1材料与方法1.1材料选取我院术前未进行化疗的结肠癌新鲜标本30例，其中男性21例，女性9例，再将所有结肠癌根治术标本经10％福尔马林液固定，石蜡包埋。1.2试剂RPMI1640培养基干粉，胎牛血清,MTT，透明质酸酶胰蛋白酶，Ⅳ型胶元蛋白酶，DNA酶，220nm薄膜滤菌器，以上试剂均来自华美生物工程公司北京分公司。绵羊抗人TS蛋白单克隆抗体，AP标记的兔抗绵羊二抗（美国Rockland公司），生物素代兔抗绵羊二抗（美国K.P.L公司）。SP试剂盒，DAB显色试剂盒（福州迈新公司）。1.3方法1.3.1肿瘤细胞培养无菌条件下取手术根治切除的结肠癌组织，置于合有500U/ml青霉素，500μg／ml链霉素清洗（10min）,将肿瘤组织剪成1mm3碎块后，置于含有Ⅳ型胶元蛋白酶（200U/g）Ⅰ型DNA酶（100U/g），Ⅴ型透明质酸酶（1500U/g）的RPMI1640培养基（4℃，20h）,离心（1000r/min，5min）两次，收集单个细胞用RPMI1640液将细胞洗两遍后，以5×105个／ml活细胞数接种于培养瓶中，加入20％胎牛血清（FBS），置于CO2培养箱中（37℃，5％CO2），次日培养细胞贴壁，3天更换一次生长液，计算肿瘤细胞群体增倍时间（36h），不用传代，直接用原代细胞进行实验。将细胞悬液浓度为2×104／ml加入96孔培养板中，每孔200μl，置于二氧化碳培养箱中（37℃，5％CO2，2h）；在96孔板中加入（150μg／ml），每孔20μl，置于二氧化碳培养箱中（37℃，5％CO2，36h）；吸弃上清每孔加入MTT应用液（5mg/ml）20μl，培养4h后，每孔再加200μl的酸化异丙醇终止反应，以上步骤均严格遵循无菌操作原则，最后用酶标仪测定每孔及光度值（测定波长540nm），以未加进行药敏的癌细胞为对照组。1.3.2免疫组化染色采用法进行免疫组化染色；将30例结肠癌石蜡切片脱蜡至水，无须抗原修复，直接浸入3％H2O2内源性酶处理10min，PBS洗3×5min；10％正常羊血清封闭10min，PBS洗3×5min；加一抗（绵羊抗人TS蛋白单克隆抗体1∶300稀释）1h，PBS洗3×5min；加生物素标记的二抗（兔抗绵羊1∶400稀释）10min，PBS洗3×5min；加SP溶液，10min，PBS洗3×5min；DAB显色，苏木素复蓝，中性树胶封片。1.3.3结果判断TS蛋白表达阳性区域在细胞浆中出现棕黄色的阳性颗粒。随机选取4个中倍视野（10×10），计算400个细胞浆中阳性细胞的百分数，当阳性细胞数目5%为（－），5％～25％（+），25％～50％（++），50％～75％（+++），75％为（++++）。计算每例结肠癌细胞体外培养的药敏试验的抑制率（％）：抑制率（％）=（1-试验孔OD540／对照孔OD540）×100％2结果30例结肠癌组织TS蛋白表达均为阳性，根据肿瘤细胞阳性数分为两组：高表达组（+++～++++），低表达组（+～++），见表1。表1TS蛋白高表达组与低表达组比较（略）表2TS表达与体外培养的癌细胞抑制率的关系（略）从表2可以看出TS高表达组的体外培养癌细胞抑制率明显低于低表达组，差别具有统计上的意义（P0.05）。3讨论广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切，一直处于其他化疗药无法替代的地位，但一些结肠癌病例对为主的化疗并不敏感，其对单药治疗的有效率仅20％［3］，本文想通过体外细胞培养，从活细胞水平上论证胸苷酸合成酶对结肠癌化疗耐药的影响。MTT法的原理是以黄色的四氮唑盐可被活细胞线粒体中的与辅酶NADP相关的脱氢酶过厚，即接受氢原子而成为不溶性的甲铒替颗粒，而死细胞无此功能，无甲铒替颗粒形成，因此用酶标仪测定的OD540值越高，说明肿瘤细胞的耐药性越强，药物抑制率越低。胸苷酸合成酶（TS）是由两个相同亚单位组成的Ⅱ聚体蛋白质，每个亚单位的分子量为36Kda，Hori等研究发现TS基定位于为类第18号染色体上［1］。TS的功能是催化尿嘧啶脱氧核苷（dUMP）甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP），这是dTMP从头合成途经中关键的步骤，而dTMP又是DNA的生物合成所必需的，因此，通过对TS进行抑制就能达到抑制DNA的生物合成,进而抑制细胞生长或增殖的作用。正是通过对TS进行抑制而发挥其抗癌活性的。进入体内后经过一系列酶促反应，最后转变为其活性代谢产物氟尿嘧啶脱氧核苷（），它在辅因子亚甲基四氢叶酸存在下，能与TS结合形成等价的三联复合物，影响dUMP与TS的结合，从而抑制了dTMP的合成，使DNA的合成受限，导致细胞生长受到抑制甚至死亡［1］。许多学者研究表明，癌组织中TS的表达水平与患者的预后呈负相关，TS的表达可以作为判断癌症患者预后的指标［］，Tachikawa和Takenoue等对肠癌患者的研究结果显示TS低表达组对的敏感性优于高表达组，其预后也明显优于TS高表达组［8,9］。Copur等［10］对人类H630肠癌细胞株与其继发耐药株等进行比较，结果显示随着细胞株耐药性的增加，细胞中的TS水平也明显增加，这也从另一方面说明了TS对细胞耐药性的影响。本研究课题从活细胞水平上对胸苷酸合成酶对结肠癌化疗耐药的影响进行了更进一步的探讨，结果显示结肠癌TS高表达组的体外培养的癌细胞对化疗药物的敏感性明显低于TS低表达组的体外培养的癌细胞，这种差别具有统计学上的意义（P＜0.05），这说明TS高表达组的患者对化疗的敏感性可能明显低于TS低表达组，因此容易产生耐药，与文献报道是相符的，进一步论证了胸苷酸合成酶的表达程度对临床结肠癌患者在化疗药物上的选择有一定的指导意义。【参考文献】［1］HoriT,TakahashiE,AyuasawaD,etal.Regionalassignmentofhumanthymidylatesynthase(TS)genetochromosomeband18p11.32bynonisotopicinsituhybridization［J］［2］LenzH.J,LeichmanCG,DanenbergKD,etal.TymidylatesynthasemRNAlevelinadenocarcinomaofthestomach:apredictorforprimarytumorresponseandoverallsurvival［J］［3］［J］.GenPharmacil,［4］YehKH,ShunCT,ChenCL,etal.Highexpressionofthymidylatesynthaseisassociatedwiththedrugresistanceofgastriccarcinomatohighdose［J］［5］JohnstonPG,LenzHJ,LeichmanCGetal.Thymidylatesynthasegeneandilinhumancolorectalandgastrictumors［J］［6］DariesMM,JohnstonPG,KaurS.,etal.Colorectallivermetastasisthymidylatesynthasestainingcorrelateswithresponsetohepaticarterialfloxuridine［J］.ClinCancerRe［7］LeichmanC.G.Thymidylatesynthaseasapredictorofresponse［J］［8］TachikawaD,ArimasandFutamiK.ImmunohistochemicalexPressionofthymidylatesynthaseasaProngosticfactorandasachemotheraPeuticindexinPatiemtswithcolorectalcarcinoma［J］［9］TakenouT,NagawaH,MatsudaK,etal.Relatonbetweenthymidylatesynthaseexpressionandsurriralincoloncarcinama,anddeterminationofappropriateapplicationof［J］.AnnSurg［10］CopurS,Aibak,DrakeJC,etal.Thymidylatesynthasegeneaumplificationin［J］.