Prescission蛋白酶制作及使用方法

Prescission蛋白酶制作及使用方法柱下酶切用酶的制作方法1LTB菌体用PBS重悬至35ml做高压裂解，最终40ml总量。上清用0.5ml流速，挂3-4ml柱子，PBS漂洗30ml。用含有10%甘油的洗脱液洗脱，每管收集体积为2ml，只取主峰，可以粗略定量，也可以取百分之一的量在Akta上用上样泵来做积分定量（参考下面的积分定量方法举例）。也可以用分光光度计定量，一般可用稀释20倍定量。马上分装成0.25mg每管，可切5ml介质。柱上酶切用酶的制作方法亲和纯化方法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，得到10ml左右洗脱液，浓缩10倍，再加入10ml含有10%甘油和2mMDTT的PBS稀释，一共浓缩三次换buffer，每次浓缩时间一般在30分钟以内。最终浓缩至10mg/ml，浓缩10分钟混匀一次。尽快分装成0.25mg每管，可切5ml介质。柱上酶切用酶的Q纯化制作方法亲和纯化方法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，收集后加水大于三分之一。过Q柱，AB液配方中含有10%甘油，8%B洗脱，50%B？直接洗下后积分定量，分装。粗略定量参考2000峰宽为10.5ml，蛋白质总量为24mg，取了12ml，浓度为2mg/ml，直接分装的话，可以用125ul和250ul每份。积分定量方法举例取10ulppase浓缩液，用本底缓冲液（PBS）稀释到500ul，用上样泵做积分定量，积分体积为325mAu*ml，可知浓缩好的蛋白质光吸收为每毫升为32.5Au，光吸收为1，浓缩好的蛋白质浓度为32.5mg/ml，一共24mg蛋白。表达1.取-80度保存的质粒pGEX-PPase转化BL21（DE3）感受态，涂布，37度孵箱培养12~16h。2.挑取单克隆到50mlLBA培养基37度培养12-15小时。3.1%接种到1LTBA中，培养3小时，4度水浴降温，加终浓度为0.2mM的IPTG，15.3度诱导培养18小时。4.4000rpm离心20分钟收菌。加入PBSE（1mMEDTA）至终体积30-40ml重悬。纯化1．高压裂解2-3次。2．1.5万转离心30分钟，留上清。3．PBSS平衡5ml的GST柱，上样，PBSS漂洗，4℃放置过夜，等RNA降解，再用含有10%甘油和0.1%Tween20的酶切buffer漂洗干净。洗脱用含10%甘油的还原性谷胱甘肽溶液，2ml每管收集，取峰尖3*1.5ml。4．上样泵灌盐酸胍再生柱子，重力流灌水，灌20%乙醇，4℃保存柱子。酶切效率确定5ul，10ul，20ul酶切PH35C蛋白3-4天，电泳检测酶切产物，全部切开了。估计10ul过夜酶切1L的培养产物足够，下次实验再做验证。保存用PCR管，分装50ul每管，冻存于-80度。使用谷胱甘肽洗脱的融合蛋白，加入1份PPase，混匀后4度过夜酶切。缓冲液1．10*PBSS（欧蒙基础）配方：5包PBS粉剂（欧蒙），加入360ml5MNaCl，定容到500ml，4℃保存。2．500ml2MTris（pH8.0），500ml2MTris（pH7.4）350ml水溶解121.1gTris碱，加转子搅拌或振荡下溶解（需要10分钟左右），加浓盐酸调pH至所需值，抽滤后4℃保存。如温度升高，可加入预冷的水降温，温度下降1度pH升高0.03。pH6.8约需盐酸160ml，pH7.4约需盐酸70ml，7.6约需60ml，8.0约需42ml，8.0约需40ml。Tris缓冲液稀释10倍pH下降0.1，故如稀释为20mM使用，则pH下降0.2。3．1L2MTris不调pH800ml水溶解242.2gTris碱，加转子搅拌，定容至1L，抽滤后4℃保存。4．500ml0.5mMEDTA将93.05g二水乙二胺四乙酸二钠加入400ml水中，加入氢氧化钠颗粒调节pH（约需10g氢氧化钠颗粒），先加入7g左右，用搅拌棒彻底搅匀，在转子搅拌下，使其大部分溶解，静置一会儿，使气泡排出，并观察沉淀量。再继续搅拌，少量加入氢氧化钠颗粒，观察pH变化，勿使其变化过快，完全溶解后，加入4℃预冷的水（此时pH升高），继续调节pH为8.0，最终定容至1L，抽滤除去杂质，避光保存于4℃。5．10%Tween202mlTween20，溶于20ml水，避光保存，千分之一稀释使用（根据GE资料）。6．250ml20*酶切buffer储存液400mMTris-HCl(pH7.0-pH8.5),3MNaCl,20mMEDTA配方：2MTris-HCL50ml5MNaCL150ml0.5MEDTA10ml工作液成分（2MTris稀释100倍使用，pH值会下降0.2）：20mMTris-HCl，150mMNaCl,1mMEDTA作为漂洗液，使用前添加0.1%TritonX100（或者Tween20），做为酶切液使用前添加0.01%Triton（或者Tween20）和1mMDTT。7．100ml20×还原性谷胱甘肽储液成分：200mM还原型谷胱甘肽，50mMNaCl，1mMEDTA，0.01%TritonX-100（用欧蒙Tween20替代），100mMTris（pH8.0）50ml离心管1支，称取6.14g还原型谷胱甘肽，加20ml5MNaCl，4ml0.5MEDTA，0.2ml10%Tween20再加水溶解至50ml，倒入100ml烧杯，再量取50ml2MTris（pH8.0），倒入100ml烧杯，搅拌溶解，滤器过滤至50ml离心管，1ml分装冻存于-20度。8．500ml7M盐酸胍称取334.4g盐酸胍，加水到450ml。定容，抽滤，室温保存。PPase信息1．PPase是人类鼻病毒蛋白酶HumanrhinovirusB从11号氨基酸（GPNTEFALSLLR），N端接入为BamH，尾端为EcoR。所用载体为pGEX4t2．pGEX4t-HR14载体表达蛋白质序列MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSGGGPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ3．蛋白质参数Numberofaminoacids:410Molecularweight:46403.5TheoreticalpI:6.80Ext.coefficient49195Abs0.1%(=1g/l)1.060,assumingallpairsofCysresiduesformcystinesExt.coefficient48820Abs0.1%(=1g/l)1.052,assumingallCysresiduesarereduced1LLB，OD0.8左右诱导，收菌。缓冲液配制：1M6.8的Tris稀释50倍（稀释10倍下降0.1），上纯化仪，温度为9.7度，pH为6.8，25度测pH值应该是6.351M7.4的Tris稀释50倍，上纯化仪，温度为9.7度，pH为7.5，25度测pH值应该是7.05，所以酶切buffer可以用这个缓冲液稀释而成。二者混合后，pH为7.25，温度升高1度，下降0.03，所以如果25度测的话，应该下降0.45，pH值为6.8裂解Buffer：40mLof50mMTris-HCl,1mMEDTA,5mMDTTatpH8.8.纯化方法：4度30分钟之内，缓缓滴入1ml10%PEI，2万转离心，上清上GST柱，用谷胱甘肽洗脱，用PPaseBuffer（添加10%甘油）透析，浓缩到10mg/ml，然后分装，10ul相当于0.1mg的酶可以切2ml介质。如果浓缩到1mg/ml，100ul分装即可。500ml酶切buffer配方1.21gTris-HCl,15ml5MNaCl,1ml500mMEDTA,调节pH7.0，500ul1MDTT使用时添加20*酶切buffer配方：400mMTris-HCl(pH7.0),3MNaCl,20mMEDTA,20mMdithiothreitol(DTT可以使用时添加）100ml配方（调pH到7.0）2MTris-HCL20ml5MNaCL60ml0.5MEDTA4ml1L储存液配方（调pH到7.0）2MTris-HCL200ml5MNaCL600ml0.5MEDTA40ml10*酶切buffer配方（用1MTispH7.4）：100ml配方（不需要调pH）1MTris-HCL20ml5MNaCL30ml0.5MEDTA2ml500储存液配方（不需要调pH）1MTris-HCL100ml5MNaCL150ml0.5MEDTA10mlSource:ComesfromHumanRhinovirus–HRV3CProtease.Thisisacysteineprotease.OurversionofthisproteaseisanN-terminalHis-GST-dual-taggedversionthatruns~47KDaonSDS-PAGE.CanberemovedbyeitherGST-orNi-affinityresins(WARNING:NeedtoremoveDTTpriortoNi-resinuse).Recognitionsite:LEVLFQ/GPisthestandardsiteinmostpGexvectors.Alternativesitescanbecleaved.LE-P4-LFQ/GP/=cleavedsiteP4=ValAlaorThr.StandardBuffer:20mMTRISpH=7.0150mMNaCl1mMDTTor5-10mMBME(TCEPTnottested)0.5mMEDTA(optional)Buffer:pHrangesfrom7.0to8.5seemoptimalTemperature:4Cisoptimalbutthisenzymewillworkatroomtemperature(4-15C).Salt:30-500mMNaClhavebeentestedwithnochangesinproteolysis.Reducingagent:Required.Need1mMDTTor5-10mMBME(TCEPhasnotbeentested).Nottoexceed2mMDTT.EDTA:(0to10mM)Oftenrequiredtominimizemetalpoisoningofthisenzyme(ieNi+2offNi-columnmayformadductsinpresenceofDTT).Firstdialyzeagainstcleavagebuffer+0.5mMEDTApriortoadditionofprotease.Detergents(TritonX-100,Tween-20,NP-40,Nonidet)0-1%(v/v).Cleavageinsolution1.FollowingelutionoftheGSTfusionproteinfromGlutathioneSepharose,dialyzetheeluateextensivelyagainstCleavageBufferinordertoremovereducedglutathionefromthesample.-Note:Alternatively,sampl