VIGS实验方案

VIGS实验方案1.VIGS载体的构建根据K5570、K4588基因3’-UTR设计一对引物，并在上、下游引物5’端分别引入PacI、NotI酶切位点，随后进行PCR扩增反应。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，回收目的扩增片段，并与pMD18-T克隆载体连接，随后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆并进一步测序验证。选择序列正确的克隆摇菌，提取质粒，分别用NotI和PacI双酶切上述载体和γ载体质粒DNA。琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒纯化回收双酶切后的载体片段和目的基因片段，将纯化回收的5570、K4588基因片段连接到γ载体多克隆位点上，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆，将序列及插入方向正确的克隆进行摇菌，并提取质粒γ-5570、γ-K4588，用于后续实验。2.质粒线性化α、γ-GFP质粒用MluⅠ酶切，β质粒用SpeⅠ酶切、γ-4470及γ-4588质粒用BssHⅡ（TAKARA）酶切。以上质粒各酶切6ug，分3管进行，每管50ul体系，加入2ug质粒。（1）α、γ-GFP质粒MluⅠ2ulα/γ-GFP2ug10×Hbuffer5ulddH2Oto50ul37℃4h（2）β质粒图1BSMV重组病毒载体图谱目的片段SpeⅠ2ulΒ质粒2ug10×Mbuffer5ulddH2Oto50ul37℃4h（3）γ-4470、γ-4588质粒BssHⅡ2ulΒ质粒2ug10×Mbuffer5ulddH2Oto50ul50℃过夜酶切反应结束后，每管各用1ul进行电泳检测，根据超螺旋的DNA在琼脂糖电泳中的迁移速率比线性化的DNA迁移率高，判断质粒是否完全线性化。在酶切反应结束后，对上述所用限制性内切酶进行灭活：MluⅠ、SpeⅠ在65℃条件下温浴20min灭活，BssHⅡ在80℃条件下温浴20min灭活。3.线性化质粒的回收纯化此步开始为RNA水平操作，所用枪尖、离心管均用0.1%DEPC处理，水为DEPC配制水，3M醋酸钠用DEPC水配制并灭菌一次，70%乙醇用DEPC水配制，无水乙醇为新的未开封过的乙醇。（1）酶切后线性化的质粒3管混合共150ul，用DEPC水定容至600ul后加入等体积的苯酚：氯仿混匀，（2）室温12000rpm，离心30min，取上清。（3）加入等体积氯仿混匀。（4）室温12000rpm，离心30min，取上清。（5）加入1/10体积3M醋酸钠，混匀后加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜。（6）4℃，12000rpm，离心10min，取上清。（7）70%乙醇洗涤沉淀一次。（8）沉淀干燥。（9）20ulDEPC水溶解。4、体外转录反应使用RiboMAXLargeScaleRNAProductionSyetems—T7（Promega）体外转录试剂盒进行体外转录反应α、β各做3个反应，按20ul体系配制：5×ReactionBuffer4ulrNTPMix（GTP2mM,else25mM）6ul线性DNA模板2ugRibom7GCAP1.5ulEnzymeMix2ulNuclease-freewaterto20ulγ-GFP、γ-5570、γ-4588各作1个反应，分别按7ul配制：5×ReactionBuffer1.4ulrNTPMix（GTP2mM,else25mM）2.1ul线性DNA模板0.7ugRibom7GCAP0.53ulEnzymeMix0.7ulNuclease-freewaterto7ul37℃4h5.病毒接种以抗纹枯病小麦CI12633作为受体，感纹枯病小麦温麦6号作为感病对照，接种重组后的BSMV病毒。将小麦材料CI12633、温麦6号的种子用蒸馏水浸泡于培养皿中，待其萌发后，种植于花盆中，室温生长。当植株生长至两叶一心期时，将病毒接种于植株的第二叶上。（1）将α、β、γ-GFP体外转录反应液各5ul混合后作为对照样品；α、β、γ-5570或γ-4588体外转录反应液各5ul混合为检验样品（α+β+γ-5570；α+β+γ-4588）。每个混合样品（15ul）加入30ulDEPC水及45ul2xGKPbuffer，混匀待用（置于冰上）。（2）戴上乳胶手套，将拇指和食指的指尖轻轻接触，在指间上用DEPC处理过的枪尖上加上8ul的体外转录反应液与2xGKPbuffer的混合液，分别将α+β+γ-GFP、α+β+γ-5570、α+β+γ-4588接种于植株的第二叶上，每个样品各接种10株抗病受体CI12633，并用45ulDEPC-H2O与45ul2xGKPbuffer混合液作为mock接种于10株抗病受体CI12633。（3）将8ul样品加于食指指腹上，并将拇指与食指轻轻摩擦，使样品均匀分布于拇指与食指指腹，用未接种手固定小麦幼苗的基部，接种手的拇指和食指压住叶片，沿着植株第二叶叶片伸展的方向，从叶底部连续摩擦到叶尖（约10-15次），将BSMV病毒接种于植株的第二叶。（4）接种完成后，将小麦幼苗移入盒子中，并向幼苗喷施DEPC水，保鲜膜覆盖，保湿48h，移去保鲜膜，24/16h光照，20℃/8h黑暗培养。