搜索
RealtimeRT-PCR实时荧光定量逆转录PCR汇报人：鞠强导师：徐莉春教授主要内容RealTimeRT-PCR简介RealTimeRT-PCR原理RealTimeRT-PCR实验RT-PCRRealTime-PCRPCR聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术逆转录PCR或者称反转录PCR，由RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。实时荧光定量PCR，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程。RealTimeRT-PCR简介实时定量PCR：实时监测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。特异性好(2%CVofCT值)灵敏度高(5copies)线性关系好、线性范围宽(7-8log)操作简单、安全、自动化程度高、防污染速度快、高通量特点广泛用于:监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰…………RealTimeRT-PCR原理基本概念荧光定量基本概念基线：扩增曲线中水平部分阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量。定量SYBRGreen法延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点–使用方便，无需复杂的设计–成本较低缺点–与非特异性产物结合，无模板特异性–试验方法较难优化–灵敏度低荧光TaqMan探针法设计特定的探针监测相关产物浓度优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐RealTimeRT-PCR实验ABI7500：使用96孔板样品量大仪器稳定结果分析直观主要设备部分器材及试剂移液枪Ep管96孔板器材无水乙醇DEPCH2O相关试剂盒试剂应用RealtimeRT-PCR研究标本中YOD1基因mRNA表达RNA提取逆转录RealtimePCR液氮研磨组织100mg加1mLTRIzol,颠倒混匀，室温5min加氯仿0.2mL（按总体积的1/5）用力摇晃，室温5min4℃，离心12000rmp10min转上层水相加0.5mL异丙醇，室温10min4℃，离心12000rmp，15min弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1mL4℃离心7500rmp，5min弃上清，干燥约5min（不能完全干燥溶于DEPC水中（20μL）立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录RNA提取注意：整个操作要带口罩及一次性手套尽可能在低温下操作整个流程所用器具应均为无RNA酶的用分光光度计测其A260/280比率高于1.9用凝胶电泳观察是完整无损的按试剂盒要求加样例：HighCapacitycDNAArchiveKit(大容量cDNA库试剂盒)逆转录反应短暂离心收集溶液到管底按以下要求进行反转录反应：25℃10min,37℃120min反应结束后-20℃保存或立即进行realtimePCR。10*ReverseTranscriotionBuffer(反转录缓冲液)10μL25*dNTP（脱氧核苷三磷酸）4μL10*随机引物10μLMultiScribeReverseTranscriptase(反转录酶)，50U/μL5μL无核酸酶水21μL每个反应的总体积50μL整个流程所用器具应均为无RNA酶Tm=55-65℃GC=30-80％引物的大小不要太长，一般在80-300bp之间都可。引物的退火温度要高，一般要在60℃以上SYBRGreen20μl体系Mix10ddH204PrimerF1PrimerR1稀释20倍的cDNA4RealTimePCR从基因库GenBank中检索YOD1的基因序列应用PrimerPremier5.0软件设计引物配制SYBRGreenRealtimePCR反应体系置于RealtimePCR仪上进行PCR反应采用相对定量2-△△CT法进行数据分析要求例SDS软件待解决问题1、PCR仪参数的设定2、SDS软件的数据分析