Rheb基因克隆总结

绒山羊成纤维细胞Rheb基因克隆1、引物设计以OvisariesRashomologenrichedinbrain(RHEB)为参考序列设计引物如下：P1:ATGCCGCAGTCCAAGTCCP2:TCACATCACCGAGCAGGAAG2、RT-PCR扩增1）反应体系（10µl）：TaKaLATaq(5U/µl)0.1µl10×LAPCRBufferⅡ(Mg2+Plus)1µlP1(10µM)1µlP2(10µM)1µlTemplatecDNA1µldNTP(2.5mMeach)1.6µld3H2O4.3µl2）循环体系：94℃4min；（94℃30sec，63℃30sec，72℃40sec）×32；72℃10min。3）PCR扩增电泳图123451：DL2000，2：RhebPCR产物，3：引物二聚体，4：β-actin,5:DL20003表达模式1）反应体系（10µl）：TaKaLATaq(5U/µl)0.1µl10×LAPCRBufferⅡ(Mg2+Plus)1µlP1(10µM)1µlP2(10µM)0.2、0.4、0.4、0.5、0.5、0.5、0.5µlcDNA1µldNTP(2.5mMeach)1.6µld3H2O5.1、4.9、4.9、4.8、4.8、4.8、4.8µl2）循环体系：94℃4min；（94℃30sec，63℃30sec，72℃40sec）×30；72℃10min。3)表达模式图睾丸脑肝肺乳腺脾肾从图中可以看出，Rheb在睾丸中的表达量最多，在脑和肝中的表达量最少，在乳腺、脾、肾中的表达量相对较多，而在肺中的量居中。4重组质粒鉴定1）酶切反应体系双酶切体系：d3H2O11uL10×H缓冲液2uL精提质粒5uLEcoRI1uLPstI1Ul单酶切体系：d3H2O12uL10×K缓冲液2uL精提质粒5uLBamHI1uL2)重组质粒鉴定图谱12341:DL2000，2:双酶切产物，3:单酶切产物，4:λ-EcoT14.4)序列ATGCCGCAGTCCAAGTCCCGGAAGATCGCGATCCTGGGCTACCGGTCTGTGGGGAAATCCTCGTTGACGATTCAGTTTGTTGAAGGCCAACTTGTTGACTCCTACGATCCAACCATAGAAAATACTTTCACAAAATTGATCACAGTAAATGGACAGGAGTATCATCTTCAGCTTGTGGACACAGCTGGGCAGGATGAATATTCCATCTTTCCTCAGACATACTCCATAGATATTAATGGTTATATTCTTGTGTATTCTGTTACATCAATCAAAAGTTTTGAAGTGATCAAAGTTATCCATGGCAAATTATTGGATATGGTGGGGAAAGTACAAGTACCTATTATGTTGGTTGGGAATAAGAAAGACCTACATATGGAAAGGGTGATCAGTTATGAAGGAGGGAAAGCGTTAGCAGAGTCTTGGAACGCAGCGTTTTTGGAATCATCTGCAAAAGAAAATCAGACTGCTGTTGATGTTTTTAGAAGGATAATTTTGGAGGCAGAAAAAATCGATGGGGCCGCTTCACAAGGAAAGTCTTCCTGCTCGGTGATGTGA总长：555bp，ORF：555bp