RIP实验技术

【实验技巧】RIP实验技术RIP实验技术导语近年来，长非编码RNA（lncRNA）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncRNA，但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。下面我们来介绍一下RIP技术。RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP（RNAimmunoprecipitation），可以说是RNA版的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。在RIP试剂盒（如Sigma的Imprint®RNAImmunoprecipitationkit）的帮助下，研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。不论是细胞质还是细胞核，都会发生RNA与蛋白的相互作用。据ActiveMotif公司产品经理KyleHondorp介绍，该公司的RNAChIP-IT®kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用DNAseI处理，最后利用磁珠进行沉淀。“如你研究的是总mRNA，那么常规RIP试剂盒更合适一些，”Hondorp说，“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”生产MagnaRIP™RNA-bindingproteinimmunoprecipitationkit的EMDMillipore公司，也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布，该产品有化学交联与native两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。除RIP以外，CLIP（UVcrosslinkingandimmunoprecipitation）也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化，不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP技术——iCLIP（individual-nucleotideresolutionCLIP），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息。据伦敦大学学院的JernejUle教授介绍，CLIP与RIP的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记，并将这些复合物进行SDS-PAGE分离，之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来，用于制备cDNA文库，以备测序分析。“CLIP要比RIP麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”Ule说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高cDNA文库的质量，最终得到准确实用的数据。”一.细胞裂解液获取A.单层细胞或者贴壁细胞处理1.冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次2.加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管3.1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min5.每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃B.悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解C.组织样品处理1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次2.加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数3.1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min5.每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃二.磁珠的准备A.实验前准备1、enpendoff管2、磁力架3、冰盒，RIPWashBuffer置于冰上4、抗体，置于冰上5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水B.磁珠准备过程1.重悬磁珠2.标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3.吸取50μl重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管4.每管加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡5.将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次6.用100μl的RIPWashBuffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中7.室温孵育30min8.将enpendoff管置于磁力架上，弃上清9.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次10.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后置于冰上三.RNA结合蛋白免疫沉淀A.准备工作1、冰盒2、360°旋转仪3、RIPWashBuffer、0.5MEDTA、RNaseInhibitor置于冰上B.RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程1.准备RIPImmunoprecipitationBuffer2.将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ulRIPImmunoprecipitationBuffer3.迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml4.4℃孵育3h至过夜5.短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清6.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次四、RNA纯化A.实验前准备1.枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶2.SaltSolutionⅠ、SaltSolutionⅡ、RIPWashBuffer、ProteinaseK、10%SDS、PrecipitateEnhancer置于冰上3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇4.DEPC水置于冰上5.离心机预冷6.冰盒B.RNA纯化过程1.准备ProteinaseKBuffer。每个样品需150ul2.用150ulProteinaseKBuffer重悬上述磁珠-抗体复合物3.55℃孵育30min4.孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中5.于每管上清液中加入250μlRIPWashBuffer6.于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min7.小心的吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管8.于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min9.小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管10.每管加入50μlSaltSolutionⅠ，15μlSaltSolutionⅡ,5μlPrecipitateEnhancer，850μl无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜11.14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清12.用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.13.10-20μlDEPC水溶解，-80℃保存，送测序RIP实验常见问题1：RIP试验需要注意什么?(1)防止RNA与蛋白非特异性结合。(2)避免RNA蛋白质结合被破坏。(3)避免外源RNAse污染。(4)抑制内源RNase的活性。(5)选择适合做RIP的抗体。(6)避免RNA结合蛋白的降解。2：为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白?(1)先进行IP或者WB，测试抗体可以与目标RBP结合。(2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。(3)尽可能选用密理博RIPAb+抗体。(4)稀释抗体成浓度梯度，进行IP测试。(5)4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。(6)确定抗体类型与ProteinA/ProteinG匹配。3：提取RNA时，蛋白酶k消化不完全是什么原因?当进行蛋白酶K消化时，确保水浴温度应设置在55℃左右，长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。4：提取RNA后，A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因?(1)需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。(2)测试提纯后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA发生了降解。5：做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应50ulBEADS?50ulbeads对应的是一个reaction，而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清(2×107cells加入100ulRIPlysisbuffer得到)，所以只需要在裂解前计数一下，并按括号中的比例加入裂解buffer，后续100ul裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。6：RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗?理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。7：因为RIP做完得到的是RNA序列，要做后续检测，比如测序、判断目标序列位置等，是不是都必须要做RT-PCR，得到逆转录的DNA后，后面就跟ChIP相同了?常见的用realtimeqRT-PCR。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量，理论上说，使用input作为判别，计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看IgG以及目的抗体富集的非特异性mRNA的量的话，那么可以找一个确定不会与目的抗体结合的RNA片段设计primer进行qPCR，用来看IgG以及目的抗体拉下来的背景情况。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等)