Westernblot发光检测中常见的问题及解决方法

Westernblot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Westernblot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Westernblot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。众所周知，Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。Westernblot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。ECL法具有灵敏度高，线性范围广等特点。图1ECL检测原理图Westernblot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。在Westernblot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长胶片的曝光时间。2.背景较高。背景深是在Westernblot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。图2Westernblot发光检测中常见的问题及比较3.非特异性条带。非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。4.显影后膜上条带处变为黄色或为白色。可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。5.条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。6.散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。Westernblot发光检测中常见问题及解决办法现象原因解决办法信号弱或无HRP过高引起底物迅速耗竭稀释一抗/二抗抗体-抗原系统敏感性过低提高抗体浓度/蛋白上样量转膜不充分/过转优化转膜条件HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物高背景HRP过高(背景较高)稀释一抗/二抗封闭时间不足延长封闭时间4度过夜最好抗体与封闭液有交叉更换封闭液(如3%BSA的TBST)TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量曝光时间过长降低曝光时间抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量条带内无显影的白点转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)精细操作膜平衡不均/油脂污染按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜膜与X光片间有气泡显影前去除气泡非特异性条带抗体交叉反应稀释一抗/二抗散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层反影(白色条带,黑色背景)HRP过高(背景较高)稀释一抗/二抗显影后膜上条带处变为黄色HRP过高(敏感性太高)稀释一抗/二抗底物化学发光ECL是Westernblot最常用的显色方法之一，因此，熟悉并掌握其中最常出现的问题及解决办法是做好Westernblot发光检测的基础。