RNA代谢.

第三章RNA代谢一.RNA是唯一已知的兼具遗传信息和催化两种功能的大分子。二.DNA指导的RNA合成（DNAdirectedRNAsynthsis）1.转录与复制的相似之处和不同之处a.依靠模板，形成磷酸二酯键的化学机制，合成方向相同；b.转录无需引物，转录只涉及一个DNA片断，一次转录只涉及一条DNA链；2.依赖DNA的RNA聚合酶催化反应方程式DNA模板(NMP)n＋NTP(NMP)n＋1＋PPiRNA链Mg＋＋生长了的RNA链特点：以双链DNA为模板时活性最强。只以一条链为模板，合成方向5‘－3’。以3’－OH末端对NTP的α磷酸基团作亲核进攻，合成5’－3’磷酸二酯键。以Watson－Crick碱基对掺入的核苷酸作选择。NTP为活性前体，合成速度50-90nt/s，一般以ATP，GTP为起始。3.转录时DNA模板上的事件a.转录时新生RNA链与模板DNA形成一小段DNA·RNA杂交链，以保证合成的精确性；b.DNA转录位点形成一段解螺旋的“转录泡”（inE.coli17bp），在RNA聚合酶前面形成正超螺旋，后面形成负超螺旋，分别由DNA拓扑酶作用下恢复正常状态。c.转录时DNA两条链的区别：模板链非模板链负链正链（与mRNA序列相同）反义链编码链（互补于mRNA链）有义链转录所需的调控顺序以非模板链表示；4.大肠杆菌RNA聚合酶E.coliRNA聚合酶有五个亚基，全部分子量390,000daltons，其中有α,β,β’,σ。由α2ββ’四个亚基组成“核心酶”（coreenzyme），α2ββ’σ组成“全酶”（holoenzyme）。此酶无3’－5’外切酶活性，合成RNA的错误几率为1/104-105。三.寻找RNA合成的起始信号－－启动子(promoter)1.转录的起始发生在DNA链的特殊位点－启动子；2.证实启动子序列的方法－－足迹法（footprinting），一种使用DNA序列分析原理建立的一种技术，用于找出某活性蛋白与DNA结合的碱基序列；3.转录单位（transcriptionunit）在转录过程中第一个核糖核苷酸掺入的DNA位点称为转录起始点，记为＋1，其左边为上游，右边为下游；转录起始点与转录终止点之间的DNA片段称为一个转录单位。4.原核生物启动子的结构特征下表为使用足迹法分析揭示的几个转录单位上游的调控顺序（启动子一级结构特征）交感顺序TTGACATATAAT－35顺序－10顺序5.RNA聚合酶在启动子上的动作a.核心酶对DNA形成松散的结合，它不能区分promoter和其它DNA顺序；b.σ因子结合于核心酶形成“全酶”，识别－35顺序，使全酶对一般顺序的亲合力降低约104倍，但σ因子使核心酶对启动子顺序亲合力增加1000倍（平均值），结合特异性增加107倍，不同启动子结合常数在106-1012之间变化，此时的RNA聚合酶与启动子形成“closedcomplex”（闭合复合物）；亲和力：一个蛋白和它的配基的吸附力。亲合力可表示为一个常数Ka，即结合常数。对抗体和配基来说:Ab+L=Ab:LKa=K1/K-1=[Ab:L]/[Ab][L]Ka的单位是克分子浓度的倒数M-1。Ka是Kd的倒数，Kd=K-1/K1=[Ab][L]/[Ab:L]K1K-1c.“闭合复合物”接着由于TATAAT顺序解螺旋而变成“开放复合物”（opencomplex），而使RNA聚合酶更加紧密结合，这时形成的复合物是不可逆的；d.开放复合物形成，核苷酸开始掺入，它新生RNA合成8-9个核苷酸残基，σ亚基被从全酶上释放，RNA链的延长由核心酶负责；e.细胞更换σ因子改变对被转录基因的特异性；普通σ因子σ70heatshockgenesσ32枯草杆菌孢子化σ70σ37σ29，以适应细胞的生理学改变。四.真核细胞有三种不同的RNA聚合酶真核生物的细胞核中有三种不同的RNA聚合酶I，II，III。1.RNA聚合酶I（polI）负责转录大分子RNA，如28sRNA，5.8sRNA以及18sRNA；2.RNA聚合酶II是真核生物主要的RNA聚合酶，它在成千上万不同的启动子上负责转录mRNA，RNA聚合酶II对真核启动子的亲和力很低，要有一些蛋白质辅因子（反式行为因子）帮助它对promoter的结合；真核启动子是“组合件”型的，它由许多“构件”（modules）组成，不同“构件”的组合构成启动子的特异性，这些构件由不同转录辅因子识别，并和RNA聚合酶组成“转录复合物”引发转录；一些真核启动子中的“构件型”顺式作用元件：名称位置交感顺序识别因子TATAbox-25-TATAAAA-TFIIDCAATbox-75-GGCCAATCT-CTF/NF1GCbox-GGGCGGSP1octamerATTTGCATOct-1……增强子（enhancers）：增强子是一种顺式行为顺序，它能增加真核启动子的利用率（转录频率），它们可以在启动子的上游或下游任何地方起作用，可以在较远的距离起作用。3.RNApolymeraseIII负责转录小分子RNA，如tRNA，5srRNA等。五.原核生物RNA合成的终止信号－－终止子（termination）1.终止子：位于转录单位末端能引起转录过程终止的DNA顺序；2.不依赖ρ因子的终止子（简单终止子），其转录产物能形成发卡结构，发卡颈部富含G≡C碱基对，其下游紧接oligo（U）串列；3.依赖ρ因子的终止子转录产物能形成发卡，，但其下游无U串列，需蛋白质因子ρ帮助才能结束转录；4.ρ蛋白有依赖ATP的RNA-DNA解螺旋酶活性，它使转录过程中的RNA-DNA杂交链解离；5.反终止作用（anti-termination）用于噬菌体基因表达的调节；RNA的剪接和修饰一.断裂基因（splitgenesorinterruptedgenes）的发现（1977）1.真核生物中为RNA或蛋白编码的DNA顺序被不编码的DNA顺序打断的基因称断裂基因；a.真核生物成熟mRNA与基因组DNA的杂交，电镜学证据；b.cDNA与为cDNA编码的染色体DNA的限制图之间的差异；cDNA，complementaryDNA，互补于mRNA的DNA；2.外显子（exon）和内含子（intron）外显子：断裂基因中转录后被保留在成熟mRNA中的DNA顺序；内含子：基因中能被转录但在RNA成熟过程中被剪除去的RNA片断对应的DNA顺序；二.真核RNA成熟过程中的自身剪接：核酶的发现RNA剪接（RNAsplicing）：从初始转录物（primarytranscript）的RNA序列中除去内含子顺序并连接外显子顺序使成为成熟mRNA的过程。1.Tetrahymena（四膜虫）rRNA的自身剪接的发现（autonomoussplicing）ThomasCech1982a.剪接无需蛋白质因子；b.GTP，GDP，GMP或Guanosine（鸟嘌呤核糖核苷）可以作为辅因子；c.四膜rRNA前体的剪接过程；6.4kb（nt）活性rRNA＋414nt（内含子）414－15－4＝“L-19RNA”（Lminus19RNA）L-19是一个真正的酶，它可以催化五聚胞苷酸的寡聚化和水解，C5的水解速度是无酶时的1010倍，L-19即是水解酶又是聚合酶。二.内含子的分类根据剪接机制不同内含子可以被分成四类：三.真核mRNA初始转录物的剪接1.用于剪接的交感顺序（保守顺序）内含子5’端是AU，3’端是AG，除此之外，3’末端AG之前是一串嘧啶核苷酸。在3’末端剪切点的上游30-50nt处还有一个分叉点（Branchsite），必含一个腺嘌呤核苷酸。GTAPynAG外显子内含子外显子2.SnRNA和剪接体（spliceosome）a.交感顺序的存在提示着相似的剪接机制，以RNA为适配器（Adaptor）；b.核和胞质中存在许多类型的小分子RNA（SmallnuclearRNA，snRNA）U1，U2，U4，U5，U6，它们和特殊蛋白的复合物称snRNPs（小核RNA核糖核蛋白体），习惯称snurps，与真核mRNA前体的剪接相关，有进化保守性；c.剪接体是含几种SnRNPs的大复合物（60S），在哺乳动物细胞中：U1SnRNA识别5’剪接点（与内含子5’末端互补）；U2SnRNA识别3’的嘧啶串列（分叉点）；U5SnRNP识别3’剪接点；(ribonucleoprotein,RNP,RNA与蛋白质复合物）U4U6snRNP用于组装剪接体；Snurps与mRNA前体形成剪接体。3.mRNA前体在剪接时形成“套索”中间体；四.真核mRNA进行末端附加修饰1.5’末端修饰大部分真核mRNA5’末端有个5’-cap，7-甲基鸟嘌呤核苷通过5’-5’三磷酸酯键连接mRNA的5’末端核苷酸；2.3’末端修饰－加接poly（A）尾巴，RNA的转录终止在加接信号AAUAAA之后；五.RNA剪接和修饰可使一个基因产生多种基因产物简单转录物真核mRNA前体复杂转录物（可被剪接成两种或更多的mRNA，多肽链）大多数复合转录物只产生一种转录产物，但同一基因在不同细胞（组织）或不同发育阶段可作不同剪接产生不同基因产物。a.多个3’末端切割位点；b.不同内含子3’末端切割点产生不同剪接产物；实例1.免疫球蛋白重链使用a方法产生不同的羧基末端，此法称poly（A）位点选择；2.在果蝇中，使用不同的剪接方法，在发育的不同阶段产生三种不同的肌球蛋白重链；3.小鼠用两种不同剪接在甲状腺中产生降钙素（calcitonin），在脑中产生“降钙素基因相关多肽”。六.稳定RNA的加工（processing）和修饰（modification）1.原核生物核糖体RNA（rRNA）a.rRNA（23s，16s，5s）是由同一个操纵子转录产生的（同一个转录单位）；b.核酸内切酶RNaseIII从初始转录物定点切割产生核糖体RNA分子；RNaseIII对切点的识别：三维结构＋碱基顺序（RNA发夹茎部），产生的16s，23srRNA分子的5‘和3’末端还需进一步加工。2.原核生物tRNA的成熟a.许多tRNA被编码于同一个操纵子中（而同一个转录单位中有时多达8个）；b.RNaseP的作用产生tRNA的5’末端，RNaseP是一种由RNA亚基和蛋白亚基组成的酶（核酸内切酶）；rnpA基因编码20kd的蛋白质亚基rnpB基因编码10kd的RNA亚基在高浓度Mg++中，RNA亚基具有全酶活性；c.RNaseD（外切酶）修饰I型tRNA前体的3’末端到－CCAOH；d.II型tRNA前体在经外切酶RNaseF修饰后，由tRNA核苷酰转移酶催化加接成熟的3’末端－CCAOH；e.tRNA的酶法修饰碱基如甲基化，脱氨，还原等；3.真核生物rRNA成熟的途径a.真核生物28s，18s，5srRNA是由同一个转录单位转录的；b.甲基化（核糖部分）是剪切rRNA前体的重要标记（marker）；4.真核tRNA的加工和修饰酵母酪氨酸tRNA的成熟修饰过程包括：a.去除5’端前导顺序；b.剪除内含子（酶法剪接）；c.替换末端－UU为－CCA；d.修饰几个碱基；七.细胞RNA的降解细菌细胞mRNA的平均半寿期为3minutes，脊椎动物mRNA的平均半寿期（halflife）为3hrs，主要由3’－5’外切核酸酶水解RNA；原核mRNA由3’末端或附近的特殊顺序形成的发卡结构提供抗核酸酶活性；真核mRNA的poly（A）尾巴及其结合蛋白可能提供抗核酸酶活性；八.多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）Graubery－Manago&chan，1955催化机制：（NMP）n＋NDP＝（NMP）n＋1＋Pi无需模板，以NDP为活性前体，反应可逆；用处：合成多核苷酸ADPpoly(A)IDPpoly(I)……ADP+UDPpoly(A+U）随机共聚物动物病毒的分类根据mRNA的生成途径和基因的成分，动物病毒可以分成六类：第三节依赖RNA的DNA合成和依赖RNA的RNA合成一