RNA提取及PCR相关技术

RNA提取及PCR相关实验技术•RNA提取•逆转录实验步骤•结果分析•PCR•qPCR内容从RNA提取到基因定性/定量流程收集并保存组织、血液、细胞等临床样本提取、纯化RNA逆转录生成cDNAPCR/qPCR进行定性/定量分析样本保存要求最好使用新鲜样品组织：取样离体后，立即分成1cm3左右的小块，每块约30-100mg，放入冻存管或锡箔纸包好，立即放置液氮罐中速冻1小时，-80℃冰箱保存。注意做好标记，避免反复冻融第一部分RNA提取RNA提取样本保存要求细胞：不建议保存。培养处理后立即提取RNA，或收集后，于Trizol液中-80℃保存。血液：不建议长期保存。或立即分离白细胞后，于Trizol液中-80℃保存。试剂耗材准备工作目的：去除RNase，防止RNA降解♦各种离心管、Tip头、冷冻保存管等塑料器皿：浸泡在0.1%的DEPC水中，过夜处理，次日烘干，高压灭菌后再次烘干。♦锡箔纸、玻璃匀浆管、研钵、手术剪刀、镊子、移液管等玻璃、金属及陶瓷制品：用锡箔纸严密包裹后，150℃高温烘烤4小时。前期准备工作♦RNase-free水：0.1％DEPC处理去离子水过夜，次日高压灭菌除去残留DEPC，分装1.5mlEppendorf管，4℃保存。♦75％乙醇：用RNase-free水配制，分装为50ml，4℃保存。♦氯仿、异丙醇、无水乙醇：新包装开封后，分装50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。样本准备组织大鼠组织样品量总RNA量（µg）脑10mg8肺10mg10肾脏10mg10心脏10mg20脾脏10mg35肝脏10mg4050－100mg组织对应1mlTrizol样本准备细胞♦悬浮细胞：生长对数期诱导后，5000×g，5min离心去除培养基，收集约5-10×106个细胞。每5-10×106个细胞对应1mlTrizol♦贴壁细胞：生长对数期诱导后，收集约5-10×106个细胞，倒掉培养基，加入预热PBS洗一次，去除PBS。每10cm2培养面积对应1mlTrizolRNA的提取注意佩戴口罩、勤更换手套组织（1）液氮预冷研钵；（2）液氮研磨，至样品呈粉末状（需8-10min）；（3）向研钵内加入1mlTrizol继续研磨，至呈不黏稠液态；（4）将混合液转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆3min；（5）将匀浆液转移至1.5mlEppendorf管，室温孵育5min；裂解RNA的提取细胞悬浮细胞：离心收集后，倒除培养液，加入1mlTrizol反复吹打细胞，至溶液不黏稠。贴壁细胞：倒除培养液，PBS洗涤一次后，直接在培养瓶或培养板中加入1mlTrizol反复吹打细胞，直至溶液不黏稠。室温孵育混合液10min后，转移至1.5mlEppendorf管裂解Trizol匀浆孵育后－80℃保存加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15s;3minatRT,12,000gx15min,4℃分层取水相，0.5mL异丙醇，颠倒混匀，10minatRT4℃，12,000gx10min（片状沉淀物为RNA）沉淀去上清，1ml75％乙醇洗涤，7,500gx5minat4℃，重复一次洗涤空气干燥，加50ulRNase-free水，55℃孵育溶解干燥溶解RNA提取优化步骤（1）对得率较低的样本，可在异丙醇沉淀一步，选用-20度过夜孵育，以增加得率。（2）对多糖含量较高的样本，可在异丙醇沉淀一步，加入高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl），-20度过夜共孵育，以去除多糖物质的污染。注意：所有试剂均需无酶水配制。RNA鉴定及初定量（1）测量OD值——得率及纯度检测得率总RNA浓度（ug/ml）＝OD260×稀释倍数×40ug/ml（通常OD260数值介于0.15-1.0之间才可靠）纯度OD260/280检测RNA纯度值在1.8-2.1之间，RNA纯度较好；值小于1.8，表明蛋白杂质较多；值大于2.2，表明RNA已降解；RNA鉴定及初定量（2）琼脂糖凝胶电泳——RNA完整性鉴定1－3ulRNA溶液上样，1％胶，100V电泳10min。完整RNA呈现明显两条带28S，18S，且28S带约为18S带亮度的两倍；有时也可见5S带RNA鉴定及初定量ElectrophoresisgeloftheRNAsample小结－RNA的保护1.提取前1.1新鲜样品及液氮速冻1.2提取工作区RNase的清除1.3实验用品RNase的清除2.提取中2.1组织破碎过程中的保护2.2细胞裂解过程中的保护2.3实验人员保护措施2.4保存过程中3.在后续的逆转录过程中仍需保持无酶环境第二部分RT-PCR逆转录PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)Antisenseprimers:oligo(dT)orrandomhexamersorGSP1ststrandcDNAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’PCRusingGSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1ststrandcDNART-PCR逆转录♦选择方法：两步法（适用于多目的基因）一步法（适用于单一目的基因）RNA逆转录♦选择逆转录引物：随机引物（适用于低丰度RNA）Oligo(dT)引物（适用于具有PolyA尾的RNA）特异性引物（适用于一步法）RNA逆转录步骤（1）取1-5ugRNA样本，65℃热变性10min；（2）配制反应体系，共20ul（以AMV为例）10×buffer2ulMgcl2(25mM)4uldNTPs(10mM)2ulRNaseinhibitor(1U/ul)0.5ulreversetranscriptase15Ureverseprimer0.5ugRNAsample1-5ugRNase-freeWater加至20ul一、逆转录反应RNA逆转录步骤（3）反应体系42℃孵育60min。如使用随机引物，先室温孵育10min后，再升温至42℃。（4）72℃，5min失活酶，置冰进行后续反应或-20℃保存。cDNA第一链已合成，可低温保存或继续后续实验聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以反应底物脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR的原理和反应过程RT-PCR逆转录PCRPCR反应准备工作：♦目的基因扩增引物设计：NCBI中查询靶基因的mRNA序列，无特殊要求可选择CDS序列作为引物设计区域。RT-PCR逆转录PCR♦mRNA序列查找（以EGFR为例）RT-PCR逆转录PCR………………………………以BLAST验证引物RT-PCR逆转录PCRPCR反应准备工作：♦选择内参：1.受不同实验处理因素时，表达恒定；2.在体内各种组织中表达恒定；3.除实验设计处理因素之外，能够与目的基因一起受同等程度的非设计其它因素影响。常用内参基因名称：β-actin、GAPDH、16Sr、18Sr（Human、Rat、Mouse）RT-PCR逆转录步骤二、PCR扩增（示例）1.cDNA第一链2ul2.10×PCRbuffer(K+)5ul3.25mMMgCl23ul(1.5mM)4.10mMdNTPs1ul(各200uM)5.50μM引物正向/反向各0.5ul(0.1~0.5uM)6.Taq酶0.5ul(1~5U)7.双蒸水38.5ul总反应体积：50ulPCRmix包含：buffer（Mg2+）dNTPsTaq酶RT-PCR逆转录步骤PCR反应条件95℃2min95℃30sec40-65℃10-120sec22-35cycle72℃60-120sec72℃10min12℃∞退火温度：引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度Tm低5℃左右。两条引物的退火温度相差不应超过4-6℃。特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5℃）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。注意事项（1）每次PCR设立对照组和阴性对照组。（2）科学做法是将内参引物加入目的基因的PCR扩增反应体系中，同时扩增作为对照。（3）将反应体系中的相同试剂预先混合，再分装成各反应管。（4）设定合适的循环次数，PCR不能进入平台期。（5）在一定范围内调整Mg2+浓度、引物浓度、退火温度，消除非特异性扩增。结果鉴定琼脂糖凝胶电泳分析结果：2％琼脂糖凝胶，取4-8ul产物上样，60V电泳40min，紫外灯下观察结果。采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描，测定灰度值。注意：灰度扫描时，选择合适的胶空白区域作为扣除的背景灰度值。基因表达的差异分析－相对定量各反应体系以内参基因为参照，计算待测基因产物与其灰度比值，作为待测基因的表达值。即待测基因产物电泳带灰度值内参基因产物电泳带灰度值双标准曲线法：待测样本基因相对表达量参照样本基因相对表达量＝待测基因相对表达量结果示例结果示例荧光定量PCR(Real-timePCR,qPCR)PCR+荧光探针/荧光染料①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。②可定量原理：经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。③无须凝胶电泳：只须反应管内直接检测。④减少污染环节：全封闭反应管。⑤结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。Log[DNA]循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=x(1+e)n指数增长期GeometricReal-timePCR相同模板进行96次扩增的扩增曲线图起始拷贝数越高，Ct值越小；起始拷贝数越低，Ct值越大与DNA结合时发光游离时不发光一种DNA小沟结合染料1．SYBRGreenI荧光染料在PCR过程中染料与DNA结合发光聚合完成聚合开始SYBRGreenI1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2.染料一结合，就产生荧光信号3.信号强度与DNA分子总数目成正比数量关系一条探针，两条引物引物位于探针的两边一条探针，两个基团前边是报告基团，后边是淬灭基团3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'２．TaqMan探针/水解探针1.每产生一条DNA链，就切断一条探针2.每切断一条探针，就产生一个单位信号3.信号强度与结合探针的DNA分子数成正比数量关系5’TaqMan探针上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QRReal-timePCR反应体系1.cDNA第一链2ul2.10μM引物正向/反向各1ul(0.1~0.5uM)3.2×SYBRGreenqPCRMix10ul4.双蒸水7ul总体积20ulSYBRGreenqPCRMix包含：SYBRGreen、buffer（Mg2+）、dNTPs、Taq酶Real-timePCR的定量方式绝对定量：通过定量标准曲线来确定起始模板的拷贝数；相对定量：用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。结果分析△△Ct法：目的基因与管家基因（内参）扩增效率相同或接近一致时，采用此法。△△Ct法举例：测定X基因在某因子作用前后的表达变化内参基因：GAPDH;实验分实验组和对照组X基因Ct值（平均值）GAPDHCt值（平均值）△Ct△△Ct2－△△Ct对照组27.3516.9810.3701实验组127.5216.8610.660.290.82实验组227.1717.0510.12-0.251.22△△Ct法X基因相对表达差异分析00.20.40.60.811.21.4对照组实验组1实验组2基因表达差异实验内容方法(试剂)质控结果判断/计算RNA分离①TrizolRNA浓度、纯度（OD260,280）Ratio(260/280)：1.8~2.0②硅质膜（柱式）完整性（变性电泳）28S/18S≈2，无拖尾，5S少逆转录（RT）cDNAsynkit(