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实验十一动物组织细胞总RNA的提取一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行鉴定。二、仪器和试剂1.仪器：超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。2.试剂：(1)细胞裂解液：异硫氰酸胍4mol/L柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L十二烷基肌氨酸钠0.5%β-巯基乙醇0.1mol/L称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。(2)10×凝胶缓冲液：吗啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）200mmol/LNaAc100mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L过滤除菌后避光保存。（3）5×变性上样缓冲液：水饱和的溴酚蓝16μl500mmol/LEDTA(pH8.0)80μl甲醛（37%）720μl甘油2ml甲酰胺3084μl10×凝胶缓冲液4ml加无RNase水至10ml，4℃可保存3个月。（4）TRIzolRNA抽提试剂（5）2mol醋酸钠（6）0.1%DEPC(7)平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（8）平衡酚、氯仿（9）无水乙醇、70%乙醇、异丙醇(10)无RNase水三、操作步骤（一）异硫氰酸胍法（PLT）1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。2.加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。4.将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.6.4℃，离心12000r/min，15min.7.弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。8.弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），?C70℃保存。（二）TRIzol试剂提取RNA1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液1ml于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5mlEp管中，于室温下静置5min。2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。3.4℃，10000r/min离心15min，RNA分布于水相中。4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl异丙醇，室温静置10min。5.4℃，10000r/min离心10min。6.弃上清液，用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。7.弃上清液，室温干燥15min.8.向干燥过的沉淀物中加入200μlDEPC处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20℃保存备用。（三）RNA检测1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。方法同实验四，用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。2.琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测（1）制备凝胶（1.2%）。称1.2g琼脂糖，加72mlDEPC处理水，加热熔化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛（37%）18ml，混匀后，倒胶。（2）制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1混匀。65℃温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。（3）上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5～2h.。（4）待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3～4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色约30min。（5）在凝胶成像系统观察并分析。四、注意事项1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70℃1小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。4.根据RNA样品的紫外吸收OD值，可计算出RNAd浓度。单链RNA[ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数纯RNAOD260/OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,说明有蛋白质等污染，应用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18SRNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化