RP_HPLC法同时测定葡萄酒_果酒_果醋中16种单体酚的含量_孙翔宇

孙翔宇，杜国荣，马婷婷，刘兴艳，王晓宇，战吉宬现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2014,Vol.30,No.12RP-HPLC法同时测定葡萄酒、果酒、果醋中16种单体酚的含量1,232121（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）（2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）（3.西安文理学院生物技术学院，陕西西安710065）摘要：新建一种同时适用于天然果蔬饮品葡萄酒、果酒、果醋中8种酚酸、4种黄烷-3-醇、3种黄酮醇、1种芪类含量测定的HPLC分析方法。使用WatersXBridgeTMShieldRP18(4.6250mm，3.5μm)色谱柱，乙腈-冰乙酸-水溶液为流动相，流速0.8mL/min，进样量20uL，梯度洗脱，柱温30.0℃，DAD检测器同时采集280nm和320nm下的信号。16种单体酚均可有效分离，各物质的含量与峰面积线性关系良好，且回收率高，重复性好，具有定量准确、快速等特点。运用该方法测定了3种葡萄酒、3种果酒、3种果醋中16种单体酚的含量。结果表明，干红葡萄酒、干白葡萄酒、桃红葡萄酒能被定量的单体酚分别有14种、14种、9种单体酚；苹果酒中能被定量的单体酚有7种，樱桃酒7种，石榴酒8种；苹果醋中能被定量的单体酚有8种，柿子醋9种，猕猴桃醋中8种。该法准确、可靠，可同时适于不同天然果蔬饮品葡萄酒、果酒、果醋中酚类物质含量的分析。关键词：葡萄酒；果酒；果醋；单体酚；反相高效液相色谱文章篇号：1673-9078(2014)12-201-209DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.12.034SimultaneousDeterminationoftheContentsof16TypesofMonophenolsinWine,FruitWine,andFruitVinegarbyRP–HPLCSUNXiang-yu1,2,DUGuo-rong3,MATing-ting2,LIUXing-yan1,WANGXiao-yu2,ZHANJi-cheng1(1.CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)(2.CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710062,China)(3.DepartmentofLifeScience,Xi’anUniversityofArtsandScience,Xi’an710065,China)Abstract:AnewmethodbasedonHPLCwasestablishedforthesimultaneousdeterminationofthecontentsofeighttypesofphenolicacids,fourtypesofflavan-3-alcohols,threetypesofflavonols,andonetypeofstilbeneinnaturalfruitandvegetableproducts,includingwine,fruitwine,andfruitvinegar.ChromatographicseparationwasperformedusingaWatersXBridgeTMShieldRP18(4.6250mm,3.5m)columnat30℃withanacetonitrile/aceticacid/watermixtureasthemobilephaseataflowrateof0.8mL/min.Theinjectionvolumewas20L;gradientelutionwasappliedandadiodearraydetector(DAD)wasusedtomonitorsignalsat280nmand320nm.All16monophenolsweresuccessfullyseparatedandtheircontentsshowedgoodlinearrelationshipswiththepeakareas.Themethodhadahighrecoveryrate,goodrepeatability,goodaccuracy,andhighspeed.Thecontentsof16typesofmonophenolsinthreewines,threefruitwines,andthreefruitvinegarsweredeterminedusingthismethod.Theresultssuggestedthatfourteen,fourteen,andninetypesofmonophenolscouldbequantifiedindryredwine,drywhitewine,androséwine,respectively;seven,seven,andeighttypescouldbequantifiedinapplewine,cherrywine,andpomegranatewine,respectively;eight,nine,andeighttypescouldbequantifiedinapplevinegar,persimmonvinegar,andkiwifruitvinegar,respectively.Theresultsindicatedthatthemethodwasaccurateandreliable,andwassuitablefortheanalysisofdifferentmonophenolsinvariousfruitandvegetabledrinksincludingwine,fruitwine,andfruitvinegar.Keywords:wine;fruitwine;fruitvinegar;monophenol;reversedphasehighperformanceliquidchromatography收稿日期：2014-05-29基金项目：国家自然科学基金（31301526）；国家十二五科技支撑计划（2012BAD31B07）；国家公益性行业科研专项（2012104019-3）作者简介：孙翔宇（1988-），男，在读博士，研究方向为葡萄科学与葡萄酒酿造通讯作者：王晓宇（1979-），男，讲师，博士，研究方向为葡萄科学与葡萄酒酿造；战吉宬（1972-），男，副教授201。所以，对葡萄酒、果酒、果醋等天然果蔬类饮品现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2014,Vol.30,No.12流行性病学研究结果显示：适量消费天然果蔬类饮品可以降低癌症、血小板聚集、心脑血管疾病和动脉粥样硬化等多种疾病的发病率[1~2]。以葡萄酒、果酒、果醋为代表的天然果蔬类饮品中含有大量的多酚类物质，这些多酚类物质不仅与天然果蔬类饮品的色泽、风味等品质指标密切相关，而且天然果蔬类饮品的各种保健功效也被认为由这些物质的抗氧化能力所贡献[2~4]中酚酸、黄烷-3-醇、黄酮醇、芪类等重要多酚类物质的分析检测具有重要意义。多酚类物质主要结构是苯环，其结构中有一个或多个羟基组。基于它们碳环结构的差异，可将多酚划分为类黄酮和非类黄酮类物质。天然果蔬类饮品中，非类黄酮类物质主要是酚酸（对羟基肉桂酸和对羟基安息香酸）和芪类（白藜芦醇）。酚酸类属于小分子量物质，包括对羟基安息香酸（没食子酸、香草酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸及龙胆酸等）、对羟基肉桂酸（咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸及它们的衍生物）；芪类主要为反式和顺式白藜芦醇。类黄酮类物质主要包括花色苷、黄酮醇和黄烷-3-醇，以及少量存在的黄酮和类黄酮醇，它们之间的区别在于苯环上的羟基和甲氧基的数量及位置不同。这些基本结构以糖基化的形式或者以相应的糖苷形式或酯化形式存在[1]。目前，常用的多酚类物质检测方法有光谱法[1]、电化学法[5]和色谱法[6~9]等。其中高效液相色谱法(HPLC)是近年来最常用的分析方法。该法具有分辨率高、分析速度快、重复性好、定量分析准确和精确度高等优点。但是由于天然果蔬类饮品中酚类物质结构复杂、种类繁多，利用HPLC分析测定天然果蔬类饮品中单体酚类物质时常常会遇到各个单体酚分离困难，单检测波长无法检出所有单体酚等问题。国内外测定果蔬类饮品中酚类物质有一些报道[6~9]，但多为分别测定酚酸、黄烷-3-醇、黄酮醇、芪类，并只适用于某一类天然果蔬饮品[6~7,11~12]。目前尚无可广泛适用于天然果蔬类饮品葡萄酒、果酒、果醋等，并同时检测酚酸类、黄酮醇、黄烷-3-醇和芪类的报道。因此，本研究的目的在于建立一种广泛适用于主要天然果蔬类饮品葡萄酒、果酒、果醋的，并可同时测定中酚酸类、黄酮醇、黄烷-3-醇和芪类的HPLC方法。以期为天然果蔬类饮品分析检测提供新的参考，促进天然果蔬类饮品产业发展。1材料与方法1.1样品202样品：葡萄酒购自大型超市，包含一款红葡萄酒、一款白葡萄酒，一款桃红葡萄酒。果酒：苹果酒，樱桃酒，石榴酒；果醋：苹果醋，柿子醋，猕猴桃醋均由本实验室酿制。1.2仪器与试剂WatersBreeze1525二元高压液相色谱仪，含Waters2487二极管阵列检测器和2414视差折光检测器，色谱工作站，温控柱温箱；WatersXBridgeTMShieldRP18(4.6250mm,3.5μm)色谱柱；BS224S天平，0.1mg，北京赛多利斯科学仪器有限公司；SHD-Ⅲ循环水式多用真空泵，巩义予华仪器设备有限公司；RE-52旋转蒸发器，上海安亭生化仪器厂；JPCQ0328型全数字超声波发生器，武汉嘉鹏电子有限公司；T-50砂芯过滤器，天津津腾实验设备有限公司。黄烷-3-醇类（儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯）、黄酮醇类（槲皮素、芦丁、根皮苷）、对羟基肉桂酸类（咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、对香豆酸）、对羟基苯甲酸类（香草酸、没食子酸、龙胆酸、水杨酸）、芪类（白藜芦醇）均购自美国Sigma公司。乙腈（色谱纯）美国Spectrum公司；甲醇（色谱纯）、乙酸、乙酸乙酯（分析纯）天津天力。1.3试验方法1.3.1标准溶液的配制准确称取儿茶素、表儿茶素等16种标准品各20.0mg，分别用甲醇定容至10mL棕色容量瓶中，得到各标准品的标准储备液，-30℃保存备用。使用前，根据实验需要将标准储备液甲醇稀释至适合浓度配制成标准工作液和混合标准工作液。1.3.2样品处理葡萄酒（30mL）→乙酸乙酯萃取3次（2倍料液比）→减压浓缩至干→提取物→甲醇溶解，定容至10mL（白葡萄酒1.5mL）→-30℃保存待测3次重复，测定样品前经0.22μm微孔滤膜过滤[10]。果酒（30mL）→乙酸乙酯萃取3次（2倍料液比）→减压浓缩至干→提取物→甲醇溶解，定容至5mL→-30℃保存待测3次重复，测定样品前经0.22μm微孔滤膜过滤[10]。果醋（100mL）→乙酸乙酯萃取3次（2倍料液比）→合并有机相→减压浓缩至干（35℃）→提取物→色谱甲醇溶解，定容至5mL→-30℃避光保存待测测定样品前经0.22μm微孔滤膜过滤后进样。1.3.3色谱条件的优化检测波长：利用Waters2487二极管阵列检测器对现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2014,Vol.30,No.1216种单体酚标准样品进行最大吸收光谱扫描，分析最适检测波长。柱温与流动相流速：试验比较了不同色谱柱温度条件下16种单体酚混合标准品以及样品中色谱峰的分离情况。同时，实验比较了不同流动相流速条件下16种单体酚混合标准品以及样品中色谱峰的分离情况，分析最佳柱温与流动相流速。洗脱梯度：依据待测物性质分析与并查阅相关