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AutomatedandReal-timeCellMigrationandCellInvasionAssayUsingtheRT-CIMTMSystem——使用RT-CIMTM系统自动化实时检测细胞迁移和侵润实验目录NO.1简介NO.2材料和方法NO.3应用NO.4总结NO.1简介RT-CIM™系统是用于检测细胞侵润和迁移的新型实时细胞分析系统。16孔RT-CIM™系统主要由4部分组成：1.W200微电子细胞分析仪2.16孔RT-CIM™工作台3.计算机（预装SP软件）4.16孔RT-CIM™检测板RT-CIM™检测板由上室板和下室板组成。上室板中的16个孔的底部具微孔膜，其下表面整合了微电子生物传感器。下室板则作为细胞培养基的容器。当上室板中的细胞通过微孔发生迁移时就可被生物传感器检测到。通过RT-CIM™系统测量的阻抗得到的指数，反映了迁移细胞的数量。在SP软件的控制下，微电子细胞分析仪连接16孔RT-CIM™工作台，自动选择16孔RT-CIM™检测板上的每个生物传感器进行测试，并把测试数据传输给软件。SP软件根据此数据得到细胞指数，并绘制曲线。RT-CIM™系统的优点：1.对16孔一次测试时间小于10s2.可灵活的配置16-96个测试孔3.系统高可靠性4.可根据需求灵活制定实验流程5.强大的数据分析能力NO.2材料和方法迁移和侵润使用RT-CIM。迁移实验和趋触性实验中一般情况下，首先，细胞血清饥饿4小时，然后用胰蛋白酶消化细胞，停止旋转，并悬浮在显示细胞密度是“0.2％牛血清白蛋白”的无血清培养基中。在此之前电镀细胞，制备涂布膜。为制备胞外外基质涂层，将稀释适当浓度的ECM并将其添加到在膜的两侧进行迁移实验和传感器侧,仅用于30分钟-1小时的趋触性实验。控制膜涂以SFM或牛血清白蛋白PBS/0.2％。涂布后，用PBS洗涤膜，并用PBS/0.2％牛血清白蛋白封阻15-30分钟。底部室都充满了牛血清白蛋白SFM/0.2％及趋化因子为完成迁移实验或完成介质趋触性实验。设备组装和细胞补充至顶端室,然后进行细胞迁移监控。对于侵润实验，所用试剂和细胞处理类似于迁移实验中所描述的方法和其它的涂层。定量迁移。经过几个小时的迁移或侵润，装置确定RTCIM位置站和最后一个细胞指数。此外，对于手动计数，设备会被分解,顶部室会被浸入的PBS洗涤。经染色后，膜顶部的细胞被轻轻擦拭除去并对膜底部一侧细胞的进行定量。定量用显微镜为4个单独栏的每个样品计数。RT-CIM迁移设备的示意图A）的横截面组装设备描绘上下腔。B）底部（膜侧）上腔显示装有金制的微型传感器。C-D）组件的上部和下部腔室的RT-CIM用的螺栓和螺丝。E）RT-CIM站是为了RT-CIM迁移的设备置于恒温箱。NO.3应用3.1代表性的细胞株和原代细胞迁移的评定：为监视迁移的侵润性细胞系MDA-MB-231和HT1080，原代细胞，人脐静脉内皮细胞和非侵润性的细胞系，顶部室中加入NIH-3T3，2和4X104细胞,底室培养基填充5％血清作为趋化因子。迁移过程每两分钟检测一次，总计超过14小时。所选择的终止点是这些细胞系的倍增时间小于消除细胞增殖时。当它通过并在膜的底面落户时，膜的集成传感器可直接连续监测底侧上的顶部室的细胞。加入细胞后，观察每个细胞系迁移的特征模式。在第一个2-4小时观察到HT1080，NIH-3T3，和人脐静脉内皮细胞的细胞指数快速增加。这通过陡峭的趋化梯度反映了存在多数移动的细胞。随着时间的推移细胞指数增加减慢。这时梯度变浅，较少的细胞迁移。与此相反，随着时间的推移迁移，MDA-MB-231细胞显示出相比其它细胞系更加持久的增长。对于所有细胞系研究RT-CIM能够测量镀层细胞密度的数量上的高低差异。代表细胞株和原细胞迁移实时定量测量A）2和4x104细胞、人脐静脉内皮细胞和MDA-MB-231B）HT1080和NIH-3T3细胞的顶端超过14小时监控室和迁移。3.2细胞迁移的定量RT-CIM系统对RT-CIM技术的重要特征之一是允许进行简单的定量分析细胞迁移。对于统计评估的质量测量，添加不同密度的HT1080和COS7细胞到顶腔的电子室，对迁移实验进行定量RT-CIM计数和手动细胞计数。类似早期观察到的HT1080迁移模式，前几个小时可观察到细胞指数快速增长，接着细胞指数增加较慢。随着时间的推移镀层细胞密度相对细胞指数计量按比例增加。要确定相关迁移定量RT-CIM与更传统的定量方法，如细胞计数，迁移电子室细胞指数值经过14个小时的细胞迁移手工计数，与电镀细胞数成反比。结果表明：细胞计数和细胞指数值与镀层细胞密度密切相关，并通过一定范围内的细胞密度，定量迁移细胞的类似的变化趋势和相对差异。此外，演示和统计学评估这些量化的电镀技术和细胞数之间的关系，测得的迁移细胞用RT-CIM和细胞计数绘制细胞数的图形和显示相关系数，这个测量显示这两个变量间有很强的关联性。图中显示迁移的细胞指数和镀层细胞数很强的相关性之间。进行COS7细胞的分析，并得到类似的结论。3.3迁移定量评估不同的趋化因子和细胞外基质（ECM）有关的细胞迁移的激活几个水溶性和非水溶性因素。细胞在响应空间梯度的定向运动被描述为可溶性因子的趋化，响应于诸如ECM的非可溶性因子被称为haptotaxis。使用RT-CIM，我们能够定量评估这些因素对迁移的效果。COS7细胞治疗各种趋化因子表现出不同的迁移模式（图4A）。在整个迁移过程中，COS7细胞与肝细胞生长因子治疗、表皮生长因子或血清治疗相比，细胞指数的变化显示最高的细胞趋化因子。为了验证这些细胞指数的变化与迁移的细胞数量，细胞染色迁移膜的底面进行计数。对于指数在14小时内比较，细胞和细胞计数细胞指数值与细胞迁移的数量。使用不同的ECM和趋化因子对原代细胞、人脐静脉内皮细胞的迁移进行定量评估。顶部室添加4X104人脐静脉内皮，细胞膜涂血清（NC）或FN，试验箱底部填充血清或VEGF作为趋化因子的介质。haptotaxis的研究3.4有代表性的细胞株入侵的定量评估除了迁移，可用RT-CIM通过生物屏障同时进行细胞浸润的评估和定量。研究侵润，可用被稀释的基质胶覆盖在膜的顶部；研究迁移，用涂有血清的膜。饥饿后的血清细胞顶室中孔的底部加入含有作为趋化因子的血清的培养基。如前所述，含血清的HT1080细胞和NIH-3T3细胞可以观察到迅速增加的细胞指数（图6A）。可知，细胞指数增加依赖于血清，无血清时细胞指数的增加很少。有趣的是，存在基质胶的条件下，观察到有5％血清的HT1080细胞的细胞指数的增加延迟了6小时，此延迟被认为是细胞所需的通过基底膜侵润和迁移而到膜的另一侧的时间。要突破基底膜的时间依赖于所用的基质胶的浓度。越稀基底膜层，时间越短，细胞通过屏障，并迁移到膜的底部（图6B）。因此，使用RT-CIM可以定量测量变化率和评估迁移发病入侵。