RT-PCR

半定量RT-PCR方法一反转录—第一链cDNA的合成参照PromegaRT-PCR试剂盒说明书进行。取2μg植物totalRNA，与Oligo（dT）引物以0.5ugprimer/ugtotalRNA的比例混合，体积不超过11μL，70℃5min，冰上冷却。加入各种反转录试剂混合：10×reversetranscriptbuffer2.5μL；RNaseInhibitor0.5μL；dNTPMixture2.0μL；ReverseTranscriptase1.0μL；RNasefreeWater补足25μL；混匀后，42℃1h；75℃10min。PCR合成第二链取第一链产物0.5μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。以拟南芥Actin7基因为反应的内标对照。方法二反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩cDNA）第一步：1.0μg拟南芥总RNA和1.0μLoligo(dT)引物，用水稀释到总体积5.0μL的体系，70℃加热5min后，迅速置冰上。第二步：在反转录作用下由随机引物引导反转录成cDNA第一条链。反应体系如下：表1RT-PCR反应体系Table1ThereactionsystemofRT-PCRMgCl2（25mM）5×RxnBufferdNTPMixture（25mM）rRNasinRibonucleaseinhibitorReverseTranscriptase总RNA2.0μL4.0μL1.0μL0.5μL1.0μL1.0μgRNAtal25.0μL反转录反应先在25℃下进行5min，然后在42℃条件下进行50min。转录反应物在70℃加热15min后置于冰上，取反转录反应物的0.5μL为模板，用如下的特异引物进行PCR反应。1.3.4目的基因的获得1.3.4.1PCR扩增目的基因PCR反应体系Table2ThereactionsystemofPCR10×PCRBuffer(含Mg2+)10mMdNTPMix10μMPrimeR10μMPrimeFcDNAE×Taq(5U/μL)ddH2O2.5μL1.0μL1.0μL1.0μL0.5μL0.2μL18.8μLTotal25.0μL按上表配制PCR反应液，反应条件如下：预变性95℃5min；变性94℃50sec，退火49～58℃60sec，延伸72℃60～150sec，32个循环；总延伸72℃10min。RealtimePCR方法一，单链cDNA的合成单链cDNA的合成采用SYBRExScriptTMRT-PCRkit(PerfectRealTime)(TaKaRa)试剂盒进行，具体操作如下：1.在冰上按如下表配制RT反应液：ReagentVolume（μL）0.5μgRNATo0.5μg5×PrimeScriptTMBuffer2μLPrimeScriptTMRTEnzymeMixⅠ0.5μLOligo(dT)12-18(50μM/L)0.5μLRandom6mers(100μM/L)0.5μLRNaseFreedH2OTo10μLTotal10μL2.将上述混合物置于42℃，15min（反转录反应）；85℃，30sec（反转录酶失活）。3.得到的单链cDNA稀释10-100倍保存于-20℃。二，RealtimePCR各cDNA样品分别用相关引物进行定量PCR反应。反应体系为20μL：PCRComponentVolume（μL）2×SYBRPrimixExTaqTM10PrimerF（10μM）0.4PrimerR（10μM）0.4cDNA模板2ddH2O7.2Total20反应条件如下：95℃10s预变性，然后46次循环：95℃5s,60℃，43s。融解曲线：63℃-95℃每0.5℃个温度梯度读板一次生成融解曲线，读板时间为2s，每个样品3管重复。反应完成后，选择PCRbaselinesubstrated模式进行数据分析和修正。以第四到第十五个循环荧光强度值标准差的十倍作为荧光阈值(Thresholdvalue)，确定不同处理间的Ct值(Cyclethreshold)。对于不同处理间的Ct值用SPSS统计软件进行差异显著性分析，用内标Actin7(At5g09810)进行标准化，计算各处理与对照间的Ct差值，用公式A＝（1＋X）△C(T)计算基因表达的变化倍数。其中A表示表达改变倍数，X表示PCR扩增效率。TA连接一般的TaqDNA聚合酶在进行PCR反应时，会在产物DNA的末端形成一个游离的A，而pMD18-T载体(TaKaRa,含有Amp抗性基因)末端带有单个T的载体，可用于PCR产物的直接克隆。连接反应体系为：表3TA连接反应体系Table3ThereactionsystemofTAligationpMD18-TVector目的DNA片段LigationSolutionⅠ0.5μL2.0μL2.5μLTotal5.0μL16℃连接2～4h。PCR产物的连接ExTaqDNA聚合酶在进行PCR反应时，会在产物的末端形成A尾，因此一些克隆载体设计成线性化的末端带有单个T的载体，可用于PCR产物的直接克隆，本试验采用的TaKaRa公司的pMD18-T载体就是这种类型的载体。其连接体系及反应条件如下：Ligationmix2.5μLpMD18-TEasyVector0.5μLPCRproduct1.5μLddH2O0.5μLTotal5.0μL反应体系在16℃下连接1h以上，连接完毕，产物保存在-20℃或直接进行转化。大肠杆菌感受态细胞的制备（一）采用CaCl2法制备感受态细胞，大肠杆菌宿主菌株为DH-5。制备方法如下（以下分子克隆部分参考分子克隆一书）：①挑取37℃划线培养16-20h平板上的大肠杆菌单菌落，接种于一个含有4mLLB的大试管中，37℃，200r/min培养过夜；吸取1mL菌液于含有50-100mLLB（或SOB）培养基的250mL三角烧瓶中，37℃振荡培养至OD600=0.3～0.4；②将50～100mL的培养基转入无菌的，冰预冷的50mL聚丙烯管中，在冰上放置10-20min，使培养物冷却至0℃；③于4℃用SorvallGS3转头（或相当的转头）以4100r/min，离心10min，除去上清液以回收细胞；④倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽；⑤每50mL初始培养液用10mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬每份细胞沉淀，冰上20-30min；⑥于4℃用SorvallGS3转头（或相当的转头）以4100r/min，离心10min，以回收细胞；倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽；细胞沉淀可再用10mL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬，重复步骤⑥-⑦一次；⑧每50mL初始培养液用2mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬每份细胞沉淀。⑨保存感受态时，加入终浓度15-25%的无菌甘油，100μL分装一份，用液氮速冻1min，保存于-70℃。注：整个过程都必须在冰上操作；必须在无菌条件下操作，重悬沉淀时一定要轻柔，切忌振荡。大肠杆菌DH5α感受态的制备（二）(1)将大肠杆菌DH5a划线于固体LB培养基上，37℃培养15h；(2)于固体平板上挑取单菌落接种于4mL液体LB培养基，37℃振荡过夜培养至OD值为0.6；(3)按体积比1：100将菌液接种至50mL液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.4；(4)冰浴30min，分装于无菌的50mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min；(5)去上清后，沉淀用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2(高压灭菌)悬浮，用枪头轻轻混匀，于冰上放置30min；(6)4000rpm，4℃离心10min，去上清，倒扣于灭过菌的滤纸上，尽量除去残留的液体；(7)沉淀用900μL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬，加入60％无菌甘油使甘油终浓度为15～20％，每管80μL分装，用液氮速冻，保存于-80℃冰箱。注：制备感受态用的枪头，离心管，60%甘油，0.1mol/LCaCl2要事先灭菌，使用前预冷,60%甘油，0.1mol/LCaCl2用去离子水配制。连接反应物对宿主感受态细胞的转化（一）①取2μL的连接产物，加入100μL感受态细胞，混匀，冰上放置30min；②将反应管快速转移42℃水浴中，准确热激90sec，不要摇动；③将反应管快速转移至冰上，不少于2min；④加入800μLLB液体培养基；⑤37℃，150r/min复苏1-2h；(50min)⑥取100μL菌液涂布于LB固体培养基上（含100mg/L的Amp）。⑦37℃下培养16-20h。连接产物的转化（二）(1)取低温保存的感受态细胞，冰上慢慢融化；(2)将5μL的TA连接反应产物加入一管感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；(3)42℃热激60sec，迅速取出立即放于冰上1-2min；(4)在无菌条件下，加600μL液体LB培养基，160rpm，37℃复苏50min；(5)在含有100μg/mLAmp的LB固体培养基上，取100μL的复苏产物用涂布棒均匀地涂布在平板上，37℃倒置培养16h左右。