RT-PCR及其产物电泳分析20161101

RT-PCR及其产物电泳分析中南大学生命科学学院实验目的熟悉RT反应的原理；掌握RT反应的操作步骤熟悉PCR反应的原理掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法实验原理RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementaryDNA）分子的过程。PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退火；（3）延伸。RT-PCR:以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表达最常用的方法。RT反应试剂（1）引物：Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA1-4%）（2）逆转录酶：鼠白血病病毒莫洛尼株（MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）（3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。（4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2mmol/L或2.5mmol/L）。（5）模板（6）RNasinPCR反应试剂（1）引物：一对，单链的10-30nt长的DNA片段。（2）TaqDNA聚合酶（3）PCR反应缓冲液：常用10×浓度，一般组成为15mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl等。（4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2mmol/L或2.5mmol/L）。（5）模板6RT-PCR原理微量移液器台式微量离心机电泳槽凝胶成像系统主要仪器电泳仪热循环仪实验步骤（1）标记一个洁净的1.5mL反应管，向其中依次加入：RNA溶液5μLRTmix15μL20μL（2）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心30s，使反应成份均匀富集于管底。（3）42℃水浴30min。RTmix的成分：RNasin、5×RT反应缓冲液、2.5mMdNTPs、Oligo(dT)16、逆转录酶(MMLV)实验步骤（4）标记一个洁净的200μL反应管，向其中依次加入：ddH2O6μL2×PCRmix10μLPrimermix2μLcDNA模板2μL20μL（5）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。PCRmix的成分：PCR反应缓冲液、2.5mMdNTPs、TaqDNA聚合酶实验步骤（6）在PCR仪上设置反应循环参数:本次实验为：94℃20s，56℃20s，72℃20s，循环数为26，最后于72℃充分延伸5min后，终止反应。（7）置反应管于PCR仪上进行热循环。（8）反应完毕后，取5μLPCR产物，于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。注意事项1.戴手套操作，避免污染。2.尽量冰上操作。3.取样准确，体系正确。4.一定要有内参。PCR平台期PCR扩增有限性-平台期经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA分子数不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。PCR的离子需要Taq酶活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。一般PCR反应中MgCl2浓度在2.0mmol/L时酶活性最高，Mg2+浓度偏高，酶活性反受抑制。变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。PCR引物用量一般PCR反应引物的终浓度为0.2～1μmol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。但引物低于0.2μmol/L时，则产量降低。引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。结果分析M123M：100bp梯级DNA分子量标志物；泳道1：阳性对照；泳道2：靶DNA扩增；泳道3：阴性对照图1PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳观察结果：①是否有扩增产物。②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增。③分子量标准电泳后区带是否分开。④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确。⑤PCR产物的产量。⑥引物二聚体。RT-PCR检测人β-actin基因表达（扩增产物长度260bp）问题及解决方法无PCR产物1.确保mRNA无降解。2.确保酶未失活。3.确保引物无降解。4.重新设置退火温度。5.重新设置变性温度。问题及解决方法PCR产物呈拖尾现象1.提高退火温度。2.减少TaqDNA聚合酶的用量。3.试用二步法进行PCR扩增。4.调节Mg2+浓度，使之最优化。TaqDNA聚合酶发挥活性需要Mg2+参与，通过Mg2+介导与模板DNA、引物及dNTP结合。通常Mg2+浓度为0.5～2.5mM，Mg2+浓度过高，将引起非特异扩增产物增多；反之，Mg2+浓度过低则导致产量降低。5.减少延伸时间。6.减少循环次数。7.设计新的引物。8.采用热启动法进行PCR。问题及解决方法引物二聚体1.防止引物3′端互补。2.设计较长的引物。3.增大模板的量。PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高，模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加。4.降低引物浓度。一般为0.1～0.5μM。引物浓度过高，将错误启动延伸（即错误引发），导致非特异性产物堆积，还可形成引物二聚体；引物浓度过低则可导致扩增产量下降。5.减少循环次数。6.提高退火温度。PCR体系的优化PCR循环参数的优化①变性95℃变性20－30秒即可使双链模板DNA完全解链为单链，变性温度过高和过低均会导致DNA聚合酶活性的丧失。②退火引物与模板的退火温度有引物的长度及GC含量决定。退火温度由Tm值确定：Tm＝4（G+C）+2(A+T),退火温度比Tm低3－12℃。③延伸延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度（70－75℃；延伸时间由扩增片段的长度决定（＜500bp30s,500-1200bp40s）。④循环次数PCR循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为25－35次，PCR产物可达最大值。PCR体系的优化PCR反应成分浓度的优化①TaqDNA聚合酶：1～2.5U/100μL反应液。②dNTP浓度：20～200μmol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机会。③Mg2+浓度：0.5～2.5mmol/L④引物浓度：0.1～0.5μmol/L总之：浓度过低，PCR扩增产量下降；浓度过高，PCR特异性下降，甚至降低扩增效率。PCR体系的优化其它措施①采用具有高校正活性外切酶的耐热DNA聚合酶。②重新设计引物。③重新准备高质量的模板（如完整性和纯度）。谢谢！