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RT-PCR常见问题与分析点击：作者：来源：日期：2007-10-25本站论坛在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物？参考见解：1、RNA被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理；在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mMDTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT；2、RNA中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复；逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂；3、多糖同RNA共沉淀：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖；4、用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列；5、起始RNA量不够：增加RNA量；对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA；6、RNA模板二级结构太多：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火；提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP；对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要在高于37℃时使用M-MLV；如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物；7、引物或模板对残余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH处理。8、靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。9、PCR没有起作用：对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物；10、PCR引物设计较差：避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。11、富含GC的模板：于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。12、镁离子浓度太低：从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。13、退火温度太高：使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带？参考见解：1、引物和模板非特异性退火：在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。2、GSP设计较差：遵循用于扩增引物设计的同样原则。3、RNA中沾染了基因组DNA：使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。4、形成引物二聚体：设计在3'端没有互补序列的引物。5、引物和模板非特异性退火：以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间；在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR；避免在引物3'端含有2到3个dG或dC；6、镁离子浓度太高：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。7、因为扩增复杂模板导致引物错误起始：使用巢式PCR或递减PCR。8、沾染外源DNA：使用抗气雾剂的吸头和UDG。9、因为二级结构导致引物结合位点无法接近：对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRxEnhancerSolution。定量RT-PCR无扩增产量相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照？参考见解：1、无cDNA合成。2、cDNA合成温度太高：降低保温温度。3、反转录cDNA产物被二级结构封闭：提高保温温度。重新设计引物。4、RNA被损害或降解：必要的话更换RNA。5、RNAse污染：维持无菌条件；加入RNase抑制剂。6、荧光探针无功能：确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。必要的话设计和合成探针。灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物?参考见解：1、初始模板RNA不充分：增加模板RNA的浓度；使用10ng-1?g的总RNA。2、RNA被损害和降解：必要的话更换RNA。3、RNAse污染：维持无菌条件；加入RNase抑制剂。4、无效的cDNA：通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂。5、无效的PCR扩增：注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调整cDNA合成温度或引物设计。信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物？参考见解：1、反应中加的样品太多：降低模板的浓度。2、模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。是否RNA不用反转录，而直接PCR克隆出新基因？参考见解：PCR的底物是DNA，一定要反转录才行的。可以将rt和pcr连续进行，主要是在同一个反映管加入taq和rt酶,逆转录完成后用高温(94c)将rt酶灭活,然后再进行pcr.但是直接进行pcr是不可以的，其实rt酶也有一定的dna聚合活性,只是比较低而已。做大鼠PEDF的rt－PCR，Pubmed上genebank中关于此物质的核酸序列太多，请问应怎样选择？有何选择原则？参考建议：建议将它们翻译成蛋白后进行比对，寻找保守序列，由此设计引物。或者查阅一下文献，看看该蛋白的保守domain，设计引物。其实登陆到genebank中的该基因序列应该是一致的，你找几个比较一下可以发现。但其前后还有些其它序列（如调控序列），每个人登陆上去的那些序列可能不尽一致，你可以不管。不过不是所有genebank中的基因序列都百分之百的正确！一般情况下序列号是NM、AC或BC的比较可信，其中NM的可信度最好，据说该种序列是经过校正的。怎样检测RT-PCR模板是否降解?电泳还是分光光度计?能看出来吗?模板的浓度不是很低吗?参考见解：RT-PCR的模板，如果是一步法，那模板是RNA，检测模板质量的方法就是检测RNA质量的方法，主要的就是电泳看28S18S和5S的亮度比；以及通过测OD260/280的比值来判断。如果用的是两步法，那模板就是cDNA一链，因为cDNA一链本身是smear，检测其质量只能通过电泳看smear的范围大小大概估计cDNA的质量。RT-PCR与Realtime有什么区别？参考见解：RT-PCR是逆转录PCR，但单独提及时，Real-timePCR也可简称为RT-PCR，如果其中包含逆转录步骤，就称为RTReal-timePCR。为什么dNTp在反复冻融的情况下容易失效，其中的分子机理是怎样的；还有没有其它容易导致dntp失效的原因？参考见解：脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP），dNDP+ATP=dNTP+DP，这里的ATP和dNTP都是高能磷酸化合物，反复的冻溶，肯定会导致结构的不稳定。有资料表明，三磷酸核苷贮存在含镁离子的溶液中会促使三磷酸降解，既如果和有Mgcl2的污染，会加快dNTP的失活。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。RNA中包含逆转录抑制剂怎么去除？参考见解：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。多糖同RNA共沉淀，怎么处理才能除去多糖？参考见解：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火？参考见解：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。起始RNA量不够，为保证试验有什么处理方法？参考见解：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。RNA模板二级结构太多？参考见解：1将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。2提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。3对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。引物或模板对残余的RNA模板敏感？参考见解：在PCR前用RNaseH处理。电泳后出现意外的条带RNA？参考见解:1被基因组DNA污染:用DNaseI预处理RNA.2用于第一链合成的寡聚dT或随机引物使用基因特异性引物.3PCR的低特异性优化PCR条件.RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？参考见解：必须；在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。曾经作过同一管的PCR，内有actin和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？参考见解：在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，Mg就更不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸，摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以不建议在同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。内参可不可以不作？参考见解：一定要做内参的，每一次不作内参的结果是不可信的。电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度。半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非能准确来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的。半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似。有的protocal上要加DTT，作用是什么？参考见解：DTT是还原剂，可延缓蛋白质的氧化，尤其保护酶中的不饱和二硫键，从而防止延缓酶的失活。一般来讲，酶的缓冲液中都或多或少地含有DTT。