垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化

东北农业大学硕士学位论文垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化特性研究姓名：姜冰申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：向文胜20080620垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化特性研究作者：姜冰学位授予单位：东北农业大学相似文献(10条)1.期刊论文杜冠华.刘艾林.张莉.胡娟娟.庾石山.石建功.DUGuan-Hua.LIUAi-Lin.ZHANGLi.HUJuan-Juan.YUShi-Shan.SHIJian-Gong天然产物中先导化合物的快速发现技术-中国天然药物2005,3(6)药物研究的历史表明,天然产物是新药发现的重要来源,提高天然产物的研究水平,提高从天然产物中发现先导化合物或药物的效率,需要技术的进步和研究方法的改进.本文根据应用现代天然产物分离提取技术和高通量药物筛选技术研究天然产物先导化合物的实际工作情况,探讨从天然产物中快速发现先导化合物的新策略和新方法,以推进活性化合物或药物先导化合物的发现进程,促进我国的创新药物研究.2.学位论文李正全从中草药中筛选抗丙型肝炎和抗SARS-CoV活性化合物的筛选方法研究2005由于天然产物蕴含着巨大的分子多样性，有可能发现与现有化合物作用机理完全不同的新的先导化合物母体。中草药作为一种天然产物体系，在我国已经有几千年的应用历史，在其使用方面积累了许多宝贵的经验，而且已有一些全新结构的先导化合物来自于中草药，可能将有更多的新化合物从中草药资源这个巨大的宝库中得到。但是由于天然产物体系存在化合物结构类型多样、含量差别大、同类型化合物扎堆等现象，对传统的筛选技术提出了很高的挑战。传统的活性追踪下的分离提取技术由于筛选速度慢、易漏筛低含量活性化合物，已不适应对天然产物体系快速开发的要求。本论文研究目的是建立新的高通量筛选方法以加速对中药体系开发利用。本文以丙型肝炎丝氨酸蛋白酶为靶酶，首先建立了酶联免疫测定(ELISA)的筛选法，并将该法用于中草药粗提物以及小分子的抗蛋白酶活性的筛选，然后基于亲和色谱技术发展了固定化酶和多克隆抗体的高通量亲和筛选方法，并在丙型肝炎丝氨酸蛋白酶体系和SARS-CoV的S2蛋白体系等应用实际中得到验证；另外基于活性筛选的结果对高山辣根菜进行了化学成分研究，试图得到其抗丙型肝炎丝氨酸蛋白酶的活性化合物。本文共分五章，各章主要内容如下：第一章绪论：综述了立题思想，亲和前沿色谱，多克隆抗体技术和抗丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶抑制剂研究状况。第二章ELISA方法的建立及抗HCVNS丝氨酸蛋白酶活性化合物的筛选：在本实验室建立了改良的抗丙型肝炎丝氨酸蛋白酶活性的酶联免疫测定(ELISA)方法，可以大大节约多肽底物的用量。这项工作也为实验室的抗丙型肝炎活性化合物的研究建立了活性测定的平台。用该方法对221种药材粗提物进行了活抗丝氨酸蛋白酶的活性测定，筛选出28种药材粗提物有体外抗丙型肝炎丝氨酸蛋白酶活性。另外研究了一系列小分子化合物的抗丙型肝炎丝氨酸蛋白酶活性。结果表明鞣质类多酚化合物具有较好的抗丙型肝炎丝氨酸蛋白酶活性，其最高活性IC50值为0.66μM，它们的活性与没食子酸取代的数量有关，而所测定的其它几类化合物则没有表现较好的活性。第三章亲和前沿色谱质谱联用法筛选中药中的抗丙型肝炎活性化合物：首先介绍了固定化酶亲合柱和多克隆抗体亲合柱的方法直接用于识别药材狭叶红景天正丁醇部分的抗HCVNS3丝氨酸蛋白酶活性化合物的前沿色谱实验和结果。通过与蛋白酶直接测活结果相比较，各化合物在两种亲和柱上均能够按照它们的活性展开，从而实现了利用固定化酶亲和柱和多克隆抗体柱对天然产物的混合物进行活性筛选的目的。由于这两种方法对活性化合物具有相同的保留顺序，因此可以互相补充用于抑制剂的筛选。本论文首次将固定化酶亲和前沿色谱方法用于中药体系中活性化合物的筛选。第四章阻断SARS侵入细胞的抑制剂的筛选：本章首先综述SARS-CoV及其药物研究现状。在实验部分，介绍了以SARS-CoV的S2蛋白为亲合固定相，首先采用亲合色谱质谱联用法对大量药材粗提物或化合物进行筛选，在短时间内即发现了2个能够与SARS的S2蛋白结合从而能抑制病毒感染细胞的抑制剂，分别为五倍子中TGG和索罗玛保中的木樨草素，他们抗野生型SARS感染的EC50分别为4.5、和10.6μM，而且TGG具有高的选择性指数，为240.0。槲皮素有由于与木樨草素具有非常类似的结构，也有较好的活性，其抗假病毒活性为83.4μM。这些结果也从另一个方面说明固定化蛋白的亲和前沿色谱法用于识别中药体系中的活性化合物是可行的。第五章传统方法研究藏药高山辣根菜化学成分：利用传统的植物化学方法，首次对在活性筛选中发现具有一定活性的藏药高山辣根菜的化学成分进行了研究，分离鉴定了10个化合物。其中三个呋喃型木质素类化合物为首次从该属植物中分离等到。3.学位论文付祥三种生物活性筛选模型的引建及其在天然产物筛选中的应用2003本论文主要由四章组成。第一章主要介绍了抗肿瘤活性筛选模型CCLT的引建及其在化合物样品批量筛选和中甸凤仙的活性追踪分离中的应用。第二章主要介绍了抗骨质疏松活性筛选模型CA-Ⅱ模型在天然植物样品筛选中的应用。第三章主要介绍了抗真菌活性筛选模型YNG在天然植物样品筛选中的应用。第四章主要综述了近年来抗骨质疏松药物筛选方法的一些进展。共计筛选了7589个样品（化合物3005个，提取物4584个），发现了354个活性样品（化合物97个，提取物257个）。其中抗肿瘤活性样品87个，抗骨质疏松活性样品100个，抗真菌活性样品167个。特别是8个化合物样品具有较强的抗肿瘤活性（IC502.5μg/ml），4个提取物或分离部位样品具有较强的抗骨质疏松活性（IC502.5μg/ml），1个化合物样品和2个提取物或分离部位样品具有较强的抗真菌活性（IC502μg/ml）。论文还对这些活性样品的结构和活性、来源与活性的关系进行了探讨。这些研究为活性化合物的进一步药效研究和活性提取物或分离部位的活性追踪分离提供了重要依据。同时中甸凤仙经CCLT的模型活性检测指导下的分离，很快发现了主要的抗肿瘤活性成分200211202（IC50=9.57μM），活性较强，有潜在研发价值。通过以上工作发现这三个体外筛选模型CCLT、CA-Ⅱ、YNG具有快速、微量、简便、高效、稳定等优点，特别适合于样品的批量筛选。下面简要介绍各章内容：第一章抗肿瘤活性筛选模型CCLT的引建及其应用CCLT模型是通过肿瘤细胞培养进行药物细胞毒性检测筛选抗肿瘤药物的方法。我们主要通过人非小细胞性肺癌细胞株A549培养，对1571个植物来源的化合物样品进行细胞毒性检测，希望能够发现对该细胞生长有较好抑制作用的化合物；并对中甸凤仙的各个提取或分离部位进行细胞毒性检测，以此指导各步分离工作，希望能从该植物提取物中寻找到抗癌作用较好的成分。我们参照美国NCI和中科院上海药物研究所的抗肿瘤细胞毒性模型筛选方法，经过一系列的条件优化，建立了CCLT模型，并对1571个植物来源的化合物样品进行了批量筛选。经过初筛后选取抑制率最高的前92个样品进行了评估；经过评估后，共发现82个活性化合物（IC50值低于10μg/ml），其中活性较好的3个化合物的IC50值小于1μg/ml，IC50值介于1-2.5μg/ml之间的样品5个，介于2.5-5μg/ml之间的样品有59个，介于5-7.5μg/ml之间的样品共10个，介于7.5-10μg/ml之间的样品共5个，并对这些活性化合物进行了结构与活性的分析。在对中甸凤仙的活性追踪分离过程中，对其粗提取、不同溶剂萃取部位和柱分离部位分离及其得到的成分共计36个样品进行了A549细胞株的抗肿瘤活性检测，发现了8个抗肿瘤活性样品，其中包括了抗肿瘤活性最强的化合物200211202，其IC50值为9.57μM。第二章抗骨质疏松活性筛选模型CA-Ⅱ的批量筛选CA-Ⅱ模型是以破骨细胞内含量丰富且对骨吸收起重要作用的碳酸酐酶Ⅱ作为靶点的体外筛选方法。我们希望通过寻找该酶的抑制剂来寻找治疗骨质疏松症的药物。该实验以样品对该酶催化其底物PNPA的酯键水解程度的影响来评价样品对该酶的抑制或促进作用。在进一步条件优化的基础上对主要来源于植物的天然产物样品进行了批量筛选，包括2840个提取物或分离部位样品及243个化合物样品，经过初筛、复筛和评估，共发现了96个提取物或分离部位样品的IC50值低于10mg/ml，4个化合物样品的IC50值低于12.5mg/ml，并探讨了这些活性样品的结构与活性、来源与活性的关系。第三章抗真菌活性筛选模型YNG的批量筛选YNG模型是对常见的三种具有代表性的条件致病菌即白色念珠菌、光滑念珠菌和烟熏曲霉菌在药物存在下培养并检测样品对真菌的抑制程度来筛选抗真菌药物的方法。我们希望通过筛选能找到对这三种条件致病真菌生长产生抑制作用的样品。我们对这几种致病菌在一定时间内与药物一同培养，通过直接比浊或间接观察细胞对染料的分解程度来检测这些真菌生长状况，评价样品的抗真菌活性。通过对这些真菌的培养，在CA-YNG模型中对329个提取物、242个化合物进行了筛选，在CA-BSA-YNG模型中对329个提取物、246个化合物进行了筛选，在CG-YNG模型中对732个提取物、462个化合物进行了筛选，在AF-YNG模型中对329个提取物、241个化合物进行了筛选，累计筛选了2910个样品。发现了对CA菌株具有抑制活性的样品9个，其中6个提取物（IC5016μg/ml）、3个化合物（IC504μg/ml）；对CG菌株具有抑制活性样品共158个，其中150个提取物（IC5016μg/ml）、8个化合物（IC504μg/ml），对BSA存在下CA菌株未发现具有抑制活性的样品，对AF菌株也未发现具有抑制活性的样品，共发现有活性的样品167个，其中11个化合物、156个提取物。并对这些活性样品的结构与活性、来源与活性进行了分析。第四章抗骨质疏松药物活性筛选方法进展本章综述了抗骨质疏松药物活性筛选方法在整体和离体动物模型和细胞水平、分子水平等方面的一些研究进展。4.学位论文王悦从天然产物中寻找丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂及其结构修饰改造2005丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)目前在世界范围内的感染人数可能达1亿7千万人，大多数感染者发展成为慢性肝炎，并较快发展到肝硬化和肝癌等终末期肝病，对人类健康危害极大。迄今还没有疗效明确的药物，因此研究新的抗HCV药物具有重要的意义和价值。HCVNS3丝氨酸蛋白酶已经在生物化学上成功表达，其复合物的晶体结构也已测得，是目前重要的抗HCV药物筛选靶酶之一。本论文沿用国内外从天然产物中寻找有活性化合物的方法，研究传统中药对HCVNS3丝氨酸蛋白酶的抑制活性。根据传统中药具有的药用背景(抗菌、抗肿瘤、抗肝炎、抗病毒)、现代医药的研究背景(文献报道成分、药理活性等)、来源及价格等因素进行选材，对39种常用中药材进行了体外抑制HCVNS3丝氨酸蛋白酶活性的筛选测定；对有活性的药材山茱萸进行主要以活性为指导的植物分离纯化，纯化得到的单体化合物进行结构鉴定及活性测定。又以两个曾经报道的具有体外抑制HCV丝氨酸蛋白酶活性的化合物为先导物进行了结构修饰改造，并对所得衍生物进行结构鉴定、活性测定及计算机模拟。我们将分子生物学、植物化学、药物化学多学科知识技术结合，成功地从中药材山茱萸中纯化得到活性较高的4个HCVNS3丝氨酸蛋白酶抑制剂纯化合物：1,2,3,6-四没食子酰β-D-吡喃葡萄糖(IC50为6.98μmol/L)、1，2，3，4，6-五没食子酰β-D-吡喃葡萄糖(IC50为5.11μmol/L)、特里马素Ⅰ(IC50为7.0μmol/L)及特里马素Ⅱ(IC50为4.8μmol/L)，其中特里马素Ⅰ和特里马素Ⅱ为首次发现具有该活性；并得到一个新的环烯醚萜甙化合物(7-O-丁基莫诺甙)及三个已知环烯醚萜甙化合物(7-O-甲基莫诺甙、7-O-乙基莫诺甙、马钱素)