基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定

基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定第1页共17页基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定摘要：作为国家卫星海洋中心组成部分，本论文主要是初步查明秋季长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类。2008年秋季，我们在长江口外海域采集的海洋悬浮物样品，利用对海洋微生物16SrRNA基因的直接扩增，克隆和测序，从而鉴定微生物的种类。通过开展本研究，我们希望能初步查明长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类，为建立海洋微生物分子生物学检测的技术体系打下一定的基础。关键词：海洋微生物，种类鉴定，16SrRNA，海洋悬浮物IdentificationsofMicroorganismfromtheOutsidewatersofChangjiangRiverEstuarybyMolecularBiologyTechniquesAbstract:BeingasamajorpartofSatelliteOceanCenterofChina,thisstudyistryingtoprimarilyinvestigatethemicroorganismspeciesintheSuspendedsolidsfromtheOutsidewatersofChangjiangRiverEstuary。Infallin2008,wecollectedSuspendedsolidssamplesfromthebiologyinvestigationspot24ofSatelliteOceanCenterofChina,thenidentifiedthemarinemicroorganismspeciesbyusingdirectamplificationsof16SrRNAgenefrommarinemicroorganism,cloningandsequencingtechniques.Inthisstudy,wehopetoidentifythemarineorganismspeciesinsedimentfromtheChinaEastSeaneartoShanghai,whichcouldprovidebasisfortheestablishmentsofmarinemicroorganismmoleculardetectiontechniquesystem.Keywords:Marinemicroorganism,speciesidentification,16SrRNA,marinesediments基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定第2页共17页基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。电源电压在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温.三、琼脂糖凝胶的制备1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。4.微生物种类的鉴定方法4.1微生物的鉴定技术分类分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平：细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。4.1.1表型鉴定法它是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定第3页共17页（1）细菌常规鉴定法：它是细菌形态和生理生化水平及蛋白质水平的鉴定,前者是最经典、最常用的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,后者包括免疫诊断技术、蛋白质图谱分析和氨基酸序列分析等。(2)细菌的数值分类和自动化鉴定：它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析,优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂,根据相似系数大小判断细菌种属间的亲源性。自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。微生物数值分类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体,具有系统化、标准化、微量化和简易化等优点,采用商品化的鉴定测试卡,将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型,可对不同来源的临床标本进行针对性鉴定,所得结果以数字方式表达,与数据库数据(手册或软件)对比得出鉴定结果。(3)化学分类鉴定法：它主要通过细菌细胞壁化学成分即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定,属的分类主要测定各种氨基酸组分,种的鉴定主要是对糖的分析.另外,还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合色素成分分析等,常使用红外光谱、气相色谱、高效液相色谱和质谱等新技术。4.1.2.分子遗传学分类鉴定法分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA进行分析,包括G+Cmol%含量测定、核酸杂交、PCR技术、16SrRNA和16～23SrRNA序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。随着分子生物学技术的发展，分子遗传学分类鉴定方法逐渐成为微生物鉴定的主要手段，其鉴定结果更具有说服力。下面我们主要对16SrRNA序列分析进行详细介绍。4.2．16SrRNA序列分析4.2.1．16SrRNA的结构与性质16SrRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA。目前,在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。核糖体是细菌唯一的细胞器,是蛋白质合成的场所,它的RNA含有3种类型:23S、16S和5SrRNA,它们分别含有的核苷酸约2900、1540和120个。60年代末,Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类,他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA(rRNA)特征序列,认为16SrRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据是:它们为细胞所共有,其功能同源且最为古老既含有保守序列又含可变序列,分子大小适合操作:它的序列变化基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定第4页共17页与进化距离相适应(陈文新1998)。5SrRNA虽易分析,但由于核苷酸少,没有足够的遗传信息用于分类研究。而23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍,分析较困难。16SrRNA的相对分子量适中,作为研究对象较理想。细胞核糖体RNA可将遗传信息得以表达,转译成蛋白质,因此可以想象这些分子具有作为种系发生的指示所必不可少的性质。在相当长的进化过程中,rRNA分子的功能几乎保持恒定,而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢,以致保留了古老祖先的一些序列。也就是说,从这种排列顺序可以检测出种系发生上的深远关系。rRNA结构既具有保守性,又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系,为系统发育重建提供线索;高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列,是属种鉴定的分子基础。可变区序列因不同细菌而异,恒定区序列基本保守,所以可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类。rRNA在细胞中含量大,一个典型的细菌中含有10000～20000个核糖体,易于提取,可以获得足够的使用量供比较研究之用。选用的PCR扩增引物及测序引物对应的序列是16SrRNA中高度保守的序列,其中PCR引物8～27位的16(+)和1512～1492位的16(-)扩增分离物的16SrRNA全基因,选择位于8～27位的16(+)、683～702N3R和1512～1492位的16(-)保守序列作为测序引物,可准确测定16SrDNA的一部分序列。根据核糖体16SrRNA结构变化规律,在所测定的区域中包括了V1、V2、V3和V44个高变区,尤其是V2这一高变区,由于进化速度相对较快,其中所包含的信息,足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此,测定16SrDNA部分序列即可达到对分离物的分子鉴定的目的。4.2.2.16SrRNA序列分析的基本原理和技术步骤通过比较各类生物16SrRNA的基因序列,从序列差异计算它们之间的进化距离,可以绘出生物进化树。因此,16SrRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中的16SrRNA的基因片段,通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SrRNA序列信息,再与16SrRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较,确定其在进化树中位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。其技术主要包括以下3个步骤。（1）基因组DNA的获得首先从微生物样品中直接提取总DNA,对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有10000～20000个核糖体,而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为1～10个左右),因此rRNA在细胞中的含量很高,易于获得较多的模板,但是RNA易于降解,RNA的提取技术基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定第5页共17页相对于DNA的提取较为复杂,一般研究多采用提取细胞总DNA,但也可根据情况选择提取rRNA。由于rRNA在死亡的细胞中很快降解,提取rRNA通过反转录钓取16SrDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞(Kurabachew,1998)。（2）16SrRNA基因片段的获得过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到K噬菌体中建立DNA库,进一步通过16SrRNA通用探针进行杂交,筛选含有16SrDNA序列的克隆(鸟枪法)。由于PCR技术的产生和发展,现在一般采用16SrRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列,或通过反转录PCR获得CrDNA序列后再进行分析。采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16SrRNA序列,而且方便了后面的