基因分子生物学实验指导

基因分子生物学实验指导基因分子生物学实验指导(硕士研究生用)王欣王勇龚燕华马宏许群彭小忠强伯勤中国协和医科大学基础医学院生物化学系分子细胞遗传实验教学中心(2006年12月)1基因分子生物学实验指导绪论欢迎同学们到分子细胞遗传实验教学中心实验室来！对于大多数同学来说，这不是第一次做实验，但是，值得一提的是，实验课的功用究竟是什么？其实，大多数教学实验在技术上是比较成熟、易于成功的。但是我们不应该因此而轻视它，我们认为，实验课不仅给学生提供一个验证理论知识、学习这一领域中有关实验技术的机会，也给他们提供了一个当科学家的机会。实验可以训练他们观察、记录、分析、判断、推理等的能力；训练他们科学地解释实验结果，清晰而富有逻辑地将结果表达出来的能力。从某种意义上说，实验课是学生正式走上科学研究或其他工作岗位前的一种培训，而不仅仅是照着实验指导完成一系列操作、昀后交份报告的课程。仔细观察、随时记录等基本素质的训练应该贯穿于每一堂实验课，使它们昀终成为学生良好的工作习惯。为此，本指导特别附上实验记录纸，以便学生能将实验结果及时的记下来。为了让学生了解如何下手做好实验记录，记什么？我们在本指导的附录部分有较详细的解释，便于学会记录。当然，完整的记录一定会收益匪浅。基因分子生物学实验课的目的和任务1.实验是科学理论的实践与论证，通过实验，使学生了解基因分子生物学知识和理论的由来。通过感性知识，加深对理性知识的理解。2.通过具体的实验操作，使学生掌握基因分子生物学的基本实验方法和技能，锻炼学生的动手能力。3.通过实验训练学生观察、比较、记录、分析、判断、推理和综合等科学思维能力、独立工作能力和事实求实的科学作风。基因分子生物学实验课的程序和要求1.预习学生在实验课前应认真预习本手册，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。2.讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验课的顺序进行独立的操作和观察。3.独立操作与观察记录实验一般都由学生独立进行。如果条件允许，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。同时，实验中要仔细观察，将实验结果及时的记下来。4.作业实验报告必须根据个人的观察，以实事求是和一丝不苟的精神忠实地记录、分析、综合。不应该抄袭教材或其他同学的报告。实验报告应于实验结束时或开始下一个实验之前呈交。5.总结实验结束后，由教师组织学生针对该次实验的主要收获及今后应注意如何改进加以2基因分子生物学实验指导讨论。实验室规则和注意事项1.严格遵守实验室的各项规章制度、遵守纪律、不得无故旷课、迟到或早退，自觉维护实验室秩序、不得大声喧哗。2.尊敬教师、服从指导，提倡独立思考、科学操作、细致观察、如实记录、自觉培养严谨、求实的科学作风和生动活泼、勇于探索的创新精神。着装整洁，进入实验室应穿白大衣，不允许穿背心、拖鞋进入实验室，否则教师有权停止其实验。3.实验课前认真阅读实验课手册，熟悉实验有关的内容，认真听取实验的注意事项，按照器械清单对照检查有无缺失，各组仪器、器械不得混用。4.在操作时必须注意安全，使用易燃、易爆、有毒、带菌等材料进行实验时，应严格按规定要求进行操作，以防失火和避免污染。5.严格遵守操作规程，爱护仪器设备、实验器械用品及室内设施。实验过程中，不能将实验室各种设备及其他实验用品带到室外，因不听指挥、不遵守操作规程、违章使用仪器设备或器械，造成人身或仪器损坏的将按学校的有关规定解决处理。6.实验结束时应将实验用品、器械清洗干净，分类整理，放回原处，请带教老师检查认可后方能离开。7.实验结束后应认真总结，进行分析和讨论，及时填写实验报告，按时交给老师。8.严禁烟火、注意安全，自觉维护实验室公共卫生，保持实验室清洁整齐，不吃零食，不乱丢废弃物。9.节约用水、电、药品及实验材料，杜绝浪费。10.建立实验室值日制度，值日生离开实验室前需协同带教老师关好水、电、门、窗。11.认真保管好自己所带的财务如（数码相机、U盘等），如因自己保管不当造成损坏或丢失，实验室管理人员概不负责赔偿。3基因分子生物学实验指导目录前言.................................................................................................................5一．APC10的生物信息学分析.................................................................10二．PCR技术扩增APC10CDNA.............................................................13三．质粒提取..............................................................................................17四．DNA琼脂糖凝胶电泳..........................................................................19五．限制性内切酶消化及鉴定..................................................................21六．DNA连接和转化..................................................................................27七．用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞......................................30八．HIS-APC10融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化........................33九．重组表达载体PET-32A-HIS-APC10的序列测定（示教）...........39十．HIS-APC10融合蛋白在PET-32A/BL21系统中的表达和鉴定.....42（一）SDS-PAGE电泳.............................................................................42（二）WESTERNBLOT..............................................................................46十一．基于细胞凋亡研究的功能实验......................................................48（一）细胞转染与基因凋亡诱导作用的观察.......................................48（二）细胞凋亡的荧光染料标记法检测...............................................51十二．附录..................................................................................................53附录一如何做实验记录..........................................................................53附录二限制性内切酶..............................................................................53附录三DNA的连接.................................................................................58附录四蛋白质分离方法..........................................................................61附录五琼脂糖凝胶电泳实验试剂的配制..............................................62附录六表达和鉴定重组蛋白相关技术和溶液配制..............................63附录七细胞凋亡实验溶液配制和相关背景知识..................................664基因分子生物学实验指导细胞分裂后期促进复合体亚基APC10的克隆、表达及功能的研究前言1．指导思想研究生教育的关键是综合素质培养，包括团结协作、科研思路、实验技能和科研道德等方面，而其核心内容为创新意识、创造能力和创业精神的培养。研究生培养不同于本科生的主要依靠传授方式获取知识，而是通过系统专业知识学习和实践，培养独立获取知识、分析问题以及独立进行科学研究的能力。综合素质的培养是一个循序渐进的过程，需要平时进行强化训练。在课程设置和安排上，要注重培养学生正确的思维方法、清晰的研究思路，从而获得从事创新性研究的能力。基于这一指导思想，我们对新开设的基因分子生物学实验课进行了如下设计，围绕本实验室的“细胞分裂后期促进复合体（APC/C，anaphasepromotingcomplex/cyclosome）”研究课题，以APC/C功能上的核心亚基APC10的克隆、表达和功能研究为主线，安排研究生完成一个较为完整的和创新性较强的科研课题，从中理解科研思路，掌握实验技能，体会实验成功与失败的感受，为将来进行科研创新工作奠定基础。由于APC/C是由多个亚基组成的E3连接酶，它的发现是人们对细胞周期调节重新审视的重要转折点，它强调了在细胞周期进程中，通过泛素-蛋白酶体途径，精确的调控和选择性地降解蛋白质的重要性。APC10作为潜在的APC/C调节亚基如何引导它们泛素化和降解的作用机制尚有大量未知的奥秘有待探索，因而通过本实验课，还有可能形成研究生与老师的互动和双向交流，碰撞出新的思想火花，扩大APC/C的研究领域，获得新的创新成果。希望研究生在本课程中不要被动接受知识，而是主动思考，拓展思路，甚至可以质疑实验结果，提出自己的新观点，使得每年的实验课程内容不断更新完善。5基因分子生物学实验指导2．研究背景细胞分裂后期促进复合体APC/C（anaphasepromotingcomplex/cyclosome）是由多个亚基组成的E3泛素连接酶，是一个分子量约~1MDa的复杂巨型分子机器，从酵母到人类在不同种属进化中高度保守。芽殖酵母的APC/C含有11个蛋白亚基，哺乳动物细胞中有12个亚基，这个数量可能还会增加。APC/CE3的发现是人们对细胞周期调节重新审视的重要转折点，它强调了在细胞周期进程中，通过泛素-蛋白酶体途径（如图fig.1），精确的调控和选择性地降解蛋白质的重要性。Fig.1DegradationofcyclinBbytheubiquitin–proteasomepathway.(王平章提供)在生理状态下，APC/C活跃于细胞周期的分裂（M）期和G1期，APC/C负责将泛素连接到M期周期蛋白上，在M末期引发周期蛋白降解，促进从分裂期的退出。它调节G1期周期蛋白的降解，加快姐妹染色体的分离，调节中期向后期的转换。使细胞得以分裂和在随后的S期进行精确的DNA复制。细胞分裂增殖有赖于对DNA精确复制和染色体分离的严格控制。一旦APC/C调节失控，将产生遗传不稳定并导致肿瘤的发生。在纯化中APC/C各亚基不但紧密相连，而且是在功能上确保细胞按正确时间分裂的必要成分。APC/C复合体中的众多亚基包括三个含重复蛋白质-蛋白质相互作用TPR（tetratricopeptiderepeat）的亚基（Cdc16p,Cdc23p,Cdc27p）；小环指结构域（RINGfinger）亚基APC11p和cullin结构域(cullind