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量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。2.siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(Nn)UU(N代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29nt之间)，NA(Nn)UU和NA(Nn)NN序列也可以。以前的研究表明，典型siRNA的三大结构特征是：长度为21～23nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。以AA?N19标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中70%～80%可产生RNAi作用。但是一些具有较小脱靶效应的siRNA序列不是以AA为起始的，所以现在不推荐以“AA为起始”作为选择标准之一[6]。最新研究表明[7,8]，27nt或29nt的siRNA与21ntsiRNA相比：（1）其抑制活性可提高数倍以上；（2）不易于诱导干扰素反应和激活PKR；（3）一些基因对21ntsiRNA不敏感，但是可以被27ntsiRNA有效的抑制；（4）与21ntSiRNA相比，27ntSiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。另外，在选择siRNA序列时，要考虑到所用启动子的类型。U6启动子要求转录产物的第一个碱基是G，正反义链均如此；H1启动子转录产物的第一位碱基为U、G、C均不影响基因的沉默效果[9]。3.siRNA3′端突出碱基的选择当siRNA的3′端突出碱基为UU时，其基因抑制效率最高；但是3′端的突出碱基不能为G，因为RNase会降解以G为末尾的RNA单链。Elbashir等［2］建议用dTdT取代3′端的2个碱基突出，增强siRNA双链复合体的稳定性。需要注意的是，由于双链siRNA中的正义链不参与对靶mRNA的识别，所以正义链的3′端突出碱基可以用dTdT替代，但是反义链3′端突出碱基必需与靶mRNA序列相同的。4.siRNA序列中G/C含量的选择在siRNA序列中，G/C含量的选择比确定以AA为起始的序列更重要。具有均衡碱基含量(即G/C含量在30%～70%)的序列可以作为siRNA候选序列；而具有较低G/C含量（30%～52%）的siRNA序列，其沉默基因效果较好[10]。5.siRNA中应避免连续的单一碱基和反向重复序列[10,11]因为连续2个以上的G和C可以降低双链RNA的内在稳定性，从而抑制RNAi作用[12]；连续3个以上的U和A可能终止由RNAPolymeraseIII介导的转录[13]。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低siRNA的有效浓度和沉默效率。6.siRNA双链的内在稳定性siRNA反义链5’端具有较低的热稳定性，即反义链5’端的第一个碱基为A或U；siRNA正义链的5’端第一个碱基为G或C。因为siRNA解旋可能从富含A/U的反义链5’端有效的起始，有利于反义链与RISC的结合，而抑制正义链与RISC的结合[14]。7.siRNA正义链的碱基偏爱性以3’端具有2个碱基突出的19ntsiRNA为例，正义链的第一位和第十九位碱基为A；正义链的第十位碱基为U；正义链的第十三位碱基不为G；正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA序列具有较高的基因沉默效率[10]。8.siRNA序列的特异性为了确保侯选siRNA序列只沉默单一的靶基因,侯选siRNA序列应在美国NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的EST或Unigene数据库进行BLAST同源性比对。当siRNA序列只同源于靶基因时，才可以用于下一步的基因功能研究。9.可能影响siRNA效能的其他因素RNA结合蛋白的结合情况；mRNA的二、三级结构；mRNA的丰度、半衰期；以及所表达蛋白质的半衰期等等[15]也可能影响siRNA的效能。有研究表明，与反义技术或核酶技术不同，在RNAi过程中，靶mRNA的二级结构对基因沉默的效果没有太大影响[16]为了使siRNA具有最大的靶向特异性，在条件允许的情况下应该尽可能的全面考虑。10.设计的siRNA序列数目目前没有发现siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因应该设计4条以上siRNA序列，进行化学合成后，通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA序列进行下一步的基因功能研究。需要注意的是，有的siRNA序列在设计时没有遵守这些指导方针，实验证明也具有很高的干扰效应，这表明，我们只能根据上述指导方针设计出理论上具有较高沉默效应的siRNA序列，siRNA的最终活性需要用实验来验证。