堆肥微生物的分子生物学研究进展

0引言随着社会的进步、科技的发展，人们也越来越关注资源和环境对人类生存和长远发展的深远影响。对可再生资源的废物利用也越来越受到人们的重视。堆肥被认为是处理有机固体废物实现资源化、无害化的有效方法[1-2]，成为近年来的研究热点。堆肥的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用[3]，堆体的腐熟速度和固体废物的降解程度都与堆体内的微生物直接相关。近年来，国内外学者对堆肥中的微生物生态进行了一系列理论和实践的研究。但是堆肥中存在着非常复杂的微生物区系，在整个堆肥过程中微生物也存在非常大的变化和演替过程，用传统的实验方法和手段难以完全认识，而且人为培养的微生物与实际生境下的菌体也存在形态和特征上的差异。现代分子生物学技术的发展，弥补了传统方法的不足，为堆肥原位微生物的研究开辟了新的途径，也为堆肥复合菌系的选育和控制堆肥过程提供行之有效的手段，但是各种分子技术都有自身的局限性，人们往往只利用其中的一种分子技术对环境样品进行研究，所得到的分析结果难免有所偏差，因此该文就国内外堆肥微生物的现代分子生物学研究进展进行综述，并对其发展趋势作出展望。116S/18SrRNA/DNA序列分析技术的应用建立在以16S/18SrRNA/DNA序列分析基础上的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下，不仅能对分子特性进行研究，而且能够用于数量检测和预测自然进化关系以及物种分类。16S/18SrRNA/DNA分子标记技术已被广泛应用到各种微生态研究领域中，如人畜动物胃肠道微生态、病原菌检测、石油勘探、垃圾渗滤液、土壤微生物等环境样品，在堆肥中的应用也大大促进了人们对堆肥微生物的全面了解。Partanen等[4]对生产性和中试阶段的生活垃圾堆肥中的细菌多样性进行了研究。对得到的1500条近全长16SrDNA序列进行分析发现，其中超过500条序列在所检测样品中只出现一次，尽管大多数序列与堆肥中已发现的微生物序列相似，但是还有部分细菌系基金项目：河南省教育厅自然基金（编号：2010B530001）第一作者简介：郭艳，女，1977年出生，讲师，博士，研究方向为畜禽粪污处理及环境微生物学。通讯地址：476000商丘师范学院生命科学系，E-mail：[e-mail].收稿日期：2010-06-04，修回日期：2010-06-18。堆肥微生物的分子生物学研究进展郭艳，张进良（商丘师范学院生命科学系，河南商丘476000）摘要：堆肥微生物是实现固体废物资源化、无害化、减量化的执行者和实施者，成为当前的研究热点。现代分子生物学技术为堆肥微生物的研究提供了新的途径。该文综述了分子生物学技术在堆肥微生物研究中的应用进展情况，并对其发展前景进行了展望。关键词：堆肥微生物；分子生物学；固体废物中图分类号：X713文献标志码：A论文编号：2010-1713RecentAdvancesinMolecularBiologyofCompostMicroorganismGuoYan,ZhangJinliang（DepartmentofLifeScience,ShangqiuNormalUniversity,ShangqiuHenan476000）Abstract:Compostmicroorganismcanaccomplishthereclamation,harmlessnessandreductionofsolidwastes,andbecomesacurrentresearchfocus.Molecularbiotechnologyprovidesthenewwaytoresearchcompostmicroorganism.Theadvancesinmolecularbiologyofcompostmicroorganismwerereviewed,andthenthedirectionsofthefutureresearchwerebrieflystated.Keywords:compostmicroorganism;molecularbiology;solidwastes中国农学通报2010,26(16):170-174ChineseAgriculturalScienceBulletin郭艳等：堆肥微生物的分子生物学研究进展统发育型（phylotypes）首次被检测到，他们经过统计学分析预测在生活垃圾堆肥中可能存在超过2000种不同的细菌系统发育型。而且他们发现中试阶段和生产性阶段的生活垃圾堆肥微生物在属水平上差别不大，而在种和菌株水平上存在很大差异。Puhl等[5]从加入了牛蹄的牛粪堆肥中分离到一株菌WCC-2265(T)，经过形态学和生化指标鉴定属于放线菌属，但是经过比较16SrRNA基因序列发现它与放线菌属中的已知菌不同，属于一个新的进化枝，命名为Actinomadurakeratinilytica，是一个新发现的降解角蛋白的放线菌。李凤等[6]采用16S/18SrRNA/DNA序列分析方法对农业有机废物和城市生活垃圾堆肥高温期的细菌和真菌种群结构及多样性进行比较分析发现，农业有机废物和城市生活垃圾16SrDNA克隆文库中分别共有18个、21个分类操作单元（OTUs），分别属于细菌域的14个、15个不同属，其18SrDNA克隆文库中分别共有8个、9个OTUs，分别属于细菌域的8个、9个不同属，因此他们推断农业有机废物堆体的优势菌为Bacillusmegaterium、Rhizobiumsp.、Phanerochaetechrysosporium、Penicilliumsp.同属或同种的菌株；城市生活垃圾堆体的优势菌为Bacillusmegaterium、Azospirillumsp.、Phanerochaetechrysosporium同种或同属的菌株。随着核酸数据库的不断补充和完善，16S/18SrRNA/DNA分子标记技术可以实现对复杂环境微生物进行快速、微量、准确简便的分类和检测，该技术有三个关键环节：首先要获得能够代表实际生境的微生物组成的基因组DNA；其次是构建16S/18SrRNA基因文库，克隆子数量要足够多，才能反映环境样本实际的微生物组成情况；最后进行16S/18SrDNA序列分析。2分子杂交技术的应用Hultman等[7]提出在构建的克隆文库中采用探针阴性筛选法可以减少测序的克隆子数目，节约测序费用，避免对已知微生物重复测序，加速对环境微生物的认知进程。具体策略就是以堆肥厂堆肥样品为材料，提取基因组DNA，以扩增的真菌ITS片段构建克隆文库，然后网格化克隆文库。与此同时针对从相似环境样品中所得到的出现频率高的菌种设计种特异性探针，与网格化的克隆文库杂交，杂交阴性的就是出现频率低的或新的微生物，然后对它们进行测序。这样就可以避免与前期工作雷同或重复，而把注意力放到堆肥中丰度小的或新菌种的发掘上，而且他们指出这种方法特别适用于对环境样品中非优势菌的检测。Hatsu等[8]从60℃高温好氧堆肥样品中分离到一株菌，通过对其进行16SrDNA序列和生理特征分析鉴定为BacillusthermodenitrificansOHT-1。为了对其进行进一步验证，采用异硫氰酸荧光素标记的16SrRNA探针与BacillusthermodenitrificansOHT-1的孢子和营养体细胞进行原位杂交，结果表明全细胞杂交试验可以用来评估实验室条件下的堆肥中BacillusthermodenitrificansOHT-1的生长情况，并且可以对孢子和营养体细胞进行定量。Franke-Whittle等[9]以堆肥中已发现的病原菌的16SrRNA基因可变区为靶序列设计寡核苷酸微阵列探针探测了堆肥微生物组成。堆肥样品分别采自每周机械翻堆一次的奥地利Vfls地区的小规模堆肥厂；奥地利Lustenau地区的每天翻堆一次的工厂化生产规模的堆肥厂；污泥堆肥样品来自奥地利ZellamSee地区和意大利Udine地区。种特异性寡核苷酸微阵列探针杂交结果表明，在上述几个堆肥样品中都存在Streptococcus,Acinetobacterlwoffii和Clostridiumtetani。而且他们主张种特异性寡核苷酸微阵列技术可作为审查堆肥样品中不同微生物存在与否的分子工具。采用针对堆肥降温期微生物的369条16SrRNA基因探针构成的微阵列与纯培养菌进行杂交，30258个杂交反应中仅188个假阳性反应（0.62%）和22个假阴性反应（0.7%）[10]，具有非常高的灵敏度，可以作为检测堆肥中细菌组成的一个理想手段。探针杂交技术虽然能够快速、原位、特异性的检测复杂环境样本中微生物状态和组成，但是在微生态中的应用受限于对可培养微生物[11]的研究，不能检测未知菌，而且在微生物群落中小于5%的菌群将不能被检测到，即使大于5%的优势种群如果DNA提取效率低的话也可能检测不到[10]。3分子标记技术的应用16S/18SrRNA/DNA序列分析技术虽然能够对环境中各种微生物进行量化，但是工作量大，要进行大量的测序工作，时间周期长且不经济，而且要求要有足够的克隆子数才能准确反映环境中真实的微生物群落组成情况。近年来，可用于监测微生物群落结构及其动态变化过程的分子标记技术被广大科研工作者引入到微生态研究中，并且发挥了巨大的作用。扩增rDNA限制性分析（ARDRA）技术在微生态研究中的应用多是结合16S/18SrDNA序列分析，目的在于在测序前先运用ARDRA技术将环境微生物中克隆的众多16S/18SrDNA片段分为多个OTUs，然后再从各个OUT中挑选1~3个克隆子进行16S/18SrDNA序列测序，这样既不影响真实的微生物多样性又能够节··171中国农学通报约测序费用。Hong等运用ARDRA技术结合传统的菌落形态观察方法将从本土堆肥化过程中分离到的412株兼氧性嗜热细菌分为24个群，事实证明ARDRA分析和传统方法得到的结果一致，均显示第17群有别于其他的23个菌群。根据扩增的rDNA序列及构建发育树分析进一步证明了第17群为在亲缘关系上接近Pseudomonasstutzer的绿脓杆菌属，而其他23菌群属于枯草杆菌，与Bacillcuslicheniformis及Bacillussonorensis有亲缘关系[12]。该研究进一步证明ARDAR可直接用于检测堆肥中微生物的多样性。笔者对猪粪堆肥过程中升温期、高温期和降温期上、中、下三层共9个样品中细菌16SrRNA基因构建克隆文库，对从每个文库中挑选的阳性克隆子进行ARDRA分析[13]，结果表明，ARDRA分析可以直观反映出各个样品的细菌多样性，更重要的可以节约大笔测序经费，经济实惠。Lee等[14]率先应用单链构象多态性（SSCP）技术分析微生物群落的组成。之后，Tebbe等[15]改进该技术，提高了SSCP图谱带型的分辨率和可读性，使之更适合用来分析较为复杂的微生物群落结构。而且该技术具有简便、快速、灵敏和适于大样本筛查的特点，并且不需要特殊的仪器，现已在环境生态、食品微生物、土壤根际微生物、堆肥微生物中得到了广泛的应用。Koschinsky等[16]以转基因玉米秸秆、马粪、木屑为堆肥原料，采用传统培养方法和分子核酸技术对堆肥样品进行研究。利用传统培养方法得到600个菌落，分为5个ARDRA组，16SrDNA序列分析表明5个ARDRA组中的3个组与Bacillus有高度相似性（大于98%）；一个组与Pseudomonasstutzeri有相似性（相似性达96~97.3%）；而第5个组与数据库中的16SrDNA序列相似性很低（不到96%），说明这个组的16SrDNA序列所代表的细菌在高温堆肥中是首次被检测到。从堆肥样品中直接提取基因组DNA，之后进行SSCP分析，结果表明细菌多样性明显高于培养法。培养法和核酸分子技术各有优缺点，培养法获得的微生物多样性要远远低于实际情况，而核酸分子技术能够检测堆肥样品中可培养和不可培养微生物的多样性，但是这种方法不能区分被检测到的对象是以活细