基于微生物的可控生物制造

生物工程学报ChinJBiotech2009,June25;25(6):909-9[e-mail]©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:March27,2009;Accepted:May14,2009Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.20774033),NaturalScienceFoundationofHubeiProvinceforDistinguishedYoungScholars(No.2008CDB279).Correspondingauthor:GuangYang.E-mail:[e-mail]国家自然科学基金项目(No.20774033),湖北省自然科学基金(杰青)项目(No.2008CDB279)资助。工业生物技术基于微生物的可控生物制造史续典,王刚,王大明,余龙江,杨光华中科技大学生命科学与技术学院国家纳米药物工程技术中心,武汉430074摘要:微生物种类丰富,尺寸涵盖纳米与微米级,是天然的可用于纳米、微米及多层次跨尺度加工的“基本单元”。目前的生物制造方法大多不适用于微生物活细胞,无法发挥其整体的生物学功能及优势。本研究探索并建立了微流控和磁控的可用于微生物活体的微纳米生物制造新方法,定位操纵和有序排列微生物活体。以微生物为微纳米机器人,诱发其特有的生物学功能,进行受控自组装等生物制造过程,由此有望设计和创制一系列新型特殊功能材料和器件。关键词:微纳生物制造,微流控技术,磁控微生物,细菌纤维素,仿生矿化Controllablebio-fabricationbasedonmicrobesXudianShi,GangWang,DamingWang,LongjiangYu,andGuangYangNationalEngineeringResearchCenterforNano-Medicine,CollegeofLifeScience&Technology,HuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,ChinaAbstract:Microorganismsinnaturehaverichvariety,whosesizesarefromnanoscaletomicroscale.Therefore,microbescanbeusedasnatural“buildingblocks”innano/micromulti-levelfabricationprocesses.Atpresent,mostofthebio-manufacturingmethodsdonotapplytodirectcontroloflivingmicrobes.Theirmicrobiologicalglobalfunctionsandsuperioritiesarenotavailable.Inthispaper,twonovelnano/microbio-fabricationapproaches,micro-fluidiccontrolmethodandmagneticcontrolmethodhavebeenestablished.Thelivingmicrobescouldbemanipulatedtoformmicro-scaledpatternsortomoveorientedly.Bytheseapproaches,livingmicrobesaretakenasnano/microrobots.Wecouldemploytheirspecificbiologicalfunctionsandregulatetheircontrollableself-assembly,whichisexpectedtodesignandcreateaseriesofnewspecialfunctionalmaterialsanddevices.Keywords:nano/microbio-fabrication,micro-fluidictechnique,magneticcontrollablemicrobes,bacterialcellulose,biomimeticmineralization生物制造是将生命科学、材料科学以及生物技术融入到制造学科中,是微纳米制造技术和生命科学交叉产生的一门新兴学科。它包括仿生制造、生物质和生物体制造,运用现代制造科学和生命科学的原理和方法,通过细胞或微生物的受控三维加工和组装,制造新材料、器件及生物系统。生物制造为微纳制造技术提供了一类全新的制造手段,扩展了传统制造领域的边界和范畴。生物制造的本质是以生物作为完成制造过程的主体,在微纳米尺度通过生物的受控自组装自装配构成各种微结构。主要包括对DNA、蛋白质、多糖等生物大分子进行有序操纵;对微生物定向诱导或有序排列,利用其天然结构及功能开发新型功能材料;以及通过细胞受控组装,完成具有新陈代谢特征的生命体成型和制造。比如通过人工诱导DNA自组装形成各种立体结构[1],对DNA正四面体进行的910ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechJune25,2009Vol.25No.6Journals.im.ac.cn公化学修饰,有望应用于制备新型化学反应模板[2]。另外,自组装多肽纳米纤维,可作为组织工程或者生物矿化支架[3]。使用基因改造过的病毒作为模板合成Au、Co3O4纳米线,具有作为锂离子电池电极材料的应用潜力[4]。YanYN等报道了以高精度三维微定位系统对细胞及生物材料进行加工组装,该方法有望用于加工人工组织器官[5]。细菌纤维素是由木醋杆菌(Acetobacterxylinum)分泌的胞外产物,是自然界中唯一的天然纳米纤维,在伤口愈合材料、人造血管以及化妆品成分、食品添加剂等方面有广泛的应用[6]。近藤首次报道了用有序高分子模板在室温下诱导木醋杆菌的生物合成过程,可在纳米尺度上控制细菌纤维素纤维的排列,并堆积成有序的三维结构材料[7]。微生物是地球上昀古老的生命体,包括细菌、真菌、病毒等,种类繁多,形态与生物学功能各异,其个体大小从几十纳米到微米级,具有极强的生命力和适应性,能够以较低成本进行大批量培养,在微纳米加工领域具有极大的应用潜力。另外,利用微生物进行材料加工是低能耗、节约土地及自然资源、保护环境的绿色工艺过程,还可定向培育新品种,因此在促进科技进步和建设和谐社会方面具有积极推动作用,具有极高的社会效益。以微生物为分子组装的机器,以微纳米尺度的过程控制方法对其进行二维数字定位以及图案化排列或者三维微操纵,由此可设计创制出具有特定功能的新材料。其关键是以合适的方法控制微生物群体的定向运动与有序排列,进而才能够利用其天然生物学功能完成自装配、有序组装等过程。目前能够用于生物制造过程控制的微纳米制造方法主要有机械作用喷射技术,直写技术、电纺丝技术、分子模板诱导合成、化学方法表面镀镍、计算机辅助仿生建模与快速成型技术等[7–12]。而这其中大多数方法不能应用于对微生物活细胞的控制,主要是因为其控制条件不够温和,不能保证在整个控制过程中微生物个体的存活以及生物学功能的完整,这就限制了其应用领域。本研究探索并建立了微流控和磁控的2种可用于微生物活体定位操纵和有序排列的微纳米生物制造新方法。微流控技术主要利用一些微米级的管道操纵和控制极少量的水溶液进行生物分析。微流控技术在微生物领域具有广泛的应用前景,WhitesidesGM等指出微流控技术作为一种工具将可应用于微生物的单细胞操作,控制胞外环境的瞬时转变,以及对微生物生理及运动的研究等[13]。LiY等报道了通过该技术和表面化学的耦合来调控多种动物细胞的定向生长[14]。本研究将微流控技术应用于对木醋杆菌的控制,通过导向微生物的定向运动来调控其胞外产物细菌纤维素的有序组装,证实了通过微流控技术可以诱导细菌纤维素纤维在微米尺度上进行图案化有序自组装。磁控方法则是源于对趋磁细菌的仿生。趋磁细菌(Magnetotacticbacteria)是一类能够沿着磁场方向运动的革兰氏阴性细菌。这类细菌体内都具有晶形独特的、由膜包裹的磁性纳米颗粒——磁小体,磁小体尺寸一般为30~140nm[15],化学成分主要是Fe3O4。细胞内的磁小体使趋磁细菌在磁场中可以作趋向性运动。通过对趋磁细菌进行仿生,用化学方法合成磁性纳米颗粒,再人工构建具有磁响应性的活性微生物细胞(以下简称磁控微生物),可以使其他种类的微生物活细胞也具有磁可控性。本研究采用仿生矿化法[16]对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞进行了表面修饰处理,成功构建了磁控微生物,观察到了磁控酵母菌的趋磁性运动。这为进一步建立磁场对磁控微生物的图案化排列奠定了良好的基础。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株木醋杆菌A.xylinum,中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,CCTCC)M207163,酿酒酵母S.cerevisiae由本实验室保存。1.1.2培养基和培养条件木醋杆菌的培养采用HestrineSchramm(HS)培养基[17](g/L):葡萄糖20,酵母粉5,蛋白胨5,柠檬酸1.14,Na2HPO4·12H2O10.3。培养条件为30oC静置培养。酿酒酵母的培养采用YPD培养基(g/L):葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20。1.1.3试剂NaCl7g/L,双蒸水配制。以下试剂使用NaCl溶液配制,CaCl21.11g/L,Na2HPO41.42g/L,NaOH0.4g/L,聚二烯丙基二甲基氯化铵(PolyDiallyldimethylammoniumChloride,PDADMAC)1g/L(Sigma-Aldrich司生产),聚丙烯酸钠(PolyAcrylicAcid,SodiumSalt,PAAS)1g/L(Sigma-Aldrich公司生产),以上均由分析纯试剂配制,使用前灭菌。磁性纳米颗粒使用γ-Fe2O3,平均粒径为20~30nm,由上海师范大学沈鹤柏教授提供。1.2实验方法1.2.1微流控技术诱导纤维素图案化有序自组装按照软蚀刻的一般制作工艺制备一个微流控芯片,并且以添加2%(W/W)琼脂糖的固体HS培养基为原料,按此方法再制备具有图案化的培养基模块。用微流控芯片测试木醋杆菌在流体推动下的运动状况;利用图案化培养基模块对木醋杆菌进行敞开体系的培养以制备微米级的图案化纤维。具体操作方史续典等:基于于微生物的可控生物制造911Journals.im.ac.cn法及条件等详见专利“一种通过微流控芯片制备图案化纤维素的方法”[18]。1.2.2磁控微生物的制备采用仿生矿化法[16],首先依靠正负电荷的相互作用在酵母细胞表面进行改性修饰,依次以PDADMAC和PAAS进行交替组装,共修饰了4层,形成昀外层为PAAS的多层高分子包裹的酵母菌。再将处理后的酵母细胞转入已加入磁性纳米颗粒的CaCl2溶液,并缓慢滴加Na2HPO4,以NaOH调节pH维持在6.8,制得表面搭载有磁性纳米颗粒的酵母细胞。具体操作方法及条件等详见专利“一种活体磁性微生物的制备方法”[19]。1.2.3表征方法用光学显微镜(OlympusIX71)观察木醋杆菌在微流控管道中的运动,以及对磁控酵母菌的趋磁性运动进行荧光观察(以0.05g/L盐酸四环素对酵母细胞表面Ca2+荧光染色,并在360~370nm紫外光下观察)。用扫描电子显微镜(SEM,QUANTA200)观察图案化的纤维素与磁控酵母菌的表面形貌,样品均经过冷冻干燥处理。用透射电子显微镜(TEM,FEITecnaiG220TWIN)