SOD实验讲义

本文以绿豆[13]为材料，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究其POD和SOD同工酶在不同超声波处理下的变化情况，探讨超声波对同工酶活力和组成的影响。2材料与仪器2.1材料绿豆种子(Mungbeanseeds),市场购得新鲜绿豆种子500g。2.2试剂2.2.1pH7.00.05mol/L磷酸缓冲液:A)0.2mol/LNa2HPO4:71.64g/LB)0.2mol/LNaH2PO4:31.21g/L0.2mol/LpH7.0:700mlA+300mlB-------定容到1L.0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液300ml+蒸馏水900ml--------配至1200mlpH7.00.05mol/L磷酸缓冲液.pH7.80.05mol/L磷酸缓冲液:A)0.2mol/LNa2HPO4:71.64g/LB)0.2mol/LNaH2PO4:31.21g/L0.2mol/LpH7.8:915mlA+85mlB-------定容到1L.0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液300ml+蒸馏水900ml--------配至1200mlpH7.80.05mol/L磷酸缓冲液.pH7.83.6*10-2mol/L磷酸缓冲液:A)0.2mol/LNa2HPO4:71.64g/LB)0.2mol/LNaH2PO4:31.21g/L0.2mol/LpH7.8:915mlA+85mlB-------定容到1L.0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液200ml+蒸馏水920ml--------配至1120mlpH7.83.6*10-2mol/L磷酸缓冲液.pH6.00.10mol/L磷酸缓冲液:A)0.2mol/LNa2HPO4：21.492g/300mlB)0.2mol/LNaH2PO4:9.363g/300ml0.2mol/LpH7.0:135mlA+165mlB-------定容到300ml.0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液300ml+蒸馏水300ml--------配至600mlpH6.00.10mol/L磷酸缓冲液.2.2.2考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。2.2.3标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白（BSA），用0.15mol/LNaCl配制成0.1mg/ml蛋白溶液。2.2.4连苯三酚试剂:连苯三酚630mg+100ml10mmol/LHCl(0.085ml36%的浓HCl，用蒸馏水配成100ml).定容到500ml.2.2.5pH8.3050mmol/LTric-HCl:A)0.1mol/LTris:12.114g-----1000ml(储备液)B)0.1mol/LHCL:浓盐酸稀释得到（8.5ml36%的浓HCl，用蒸馏水配成1000ml）(储备液)0.05mol/LpH8.3:50mlA+19.9mlB-------定容到100ml.2.2.6POD酶活力测量的反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。2.2.7聚丙烯酰胺凝胶系统的配制（1）A液：1mol/LHCl48.0毫升，Tris36.6克，TEMED2毫升，加水至100毫升，pH8.9。（2）B液：丙烯酰胺56克；甲叉双丙烯酰胺1.47克加水至200毫升。（3）C液：过硫酸铵（用前配制）2.8％，配100ml。2.2.8电极缓冲液配制：Tris6.06克，甘氨酸25.82克，加水至1000毫升、pH8.3、使用时稀释10倍。倒入电极缓冲液时应将电泳槽倾斜，缓慢倒入，并同时缓慢将电泳槽放平，以驱除凝胶下方的气泡。2.2.9抗坏血酸-联苯胺过氧化物酶染液：抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中再加蒸馏水72ml）20毫升，3％H2O24毫升，H2O76毫升。2.2.10溴酚蓝染液：溴酚蓝1mg，溶于100ml蒸馏水中。2.2.11脱色液配制：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml2.2.12其他试剂:联苯胺、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、氰化钾（KCN）、EDTA二钠盐、PEG6000、固体硫酸铵、碳酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵、蔗糖、溴酚蓝。2.3、仪器与用品2.3.1主要仪器1、电泳槽，北京东方特力科贸中心；2、DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；3、惠能多功能食物搅拌器;4、UV-2401紫外分光光度计;5、UV-2000紫外可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;6、玻璃比色皿,尤尼柯(上海)仪器有限公司;7、JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;8、HITACHICR21高速冷冻离心机;9、GT10-2高速离心机,北京时代北利离心机有限公司;10、TP-220电子天平湘仪天平仪器设备有限公司；11、THD-3510W低温恒温槽,宁波天恒仪器厂;12、LRH-150生化培养箱，上海一恒科技有限公司；2.3.2主要用品移液枪、枪头、1ml玻璃注射器、6＃针头、电炉、烧杯、玻棒、纱布、量筒、定量瓶、试管、透析袋、锥形瓶。3方法3.1POD酶粗酶液提取取500g绿豆洗净，蒸馏水浸泡24小时，然后将其平铺于放有湿润纱布的盘子，放入25℃的恒温箱中，避光培养4天，让其发芽，取绿豆芽的上胚芽50g加入500mlpH70.05mol/L磷酸缓冲液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤后，酶液在4℃,以5000r/min离心10min收集上清液.3.2SOD酶浓缩液提取取500g绿豆洗涤，蒸馏水浸泡过夜，称量300g浸泡后的绿豆加入3000mlpH70.05mol/L磷酸缓冲液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤后，酶液在4℃,以5000r/min离心10min收集上清液,加入硫酸铵至30%饱和度(16.4g/100ml清液）,5℃静置8Hr以上后离心.3.4蛋白质含量测定3.4.1牛血清蛋白标准曲线的制作:按下表3加入试剂,混匀静置2分钟,以1号管为空白调零点,测下各管的A595值,以吸光值(A595)为纵坐标,每管蛋白质含量为横坐标作出标准曲线.表3试管号123456S1S2S3S4标准蛋白/µl0100200300400500样品体积/µl5010050100每管中蛋白含量/(µg)01020304050水/ul5004003002001000450400450400G-250染色液/ml3333333333室温静置2minA5953.4.2样品蛋白质含量测定:取未知浓度的蛋白质(通过适当稀释使其浓度控制在测量有有效范围内),加到试管内,再加入G250染色液3ml混匀,测其595nm下的吸光度,对照标准曲线求出蛋白质含量,计算其浓度.（表示为mgPr/g材料）3.5酶活性测定3.5.1POD酶活力测定操作步骤1.取出贮于冷处备用的粗酶液。2.取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长470nm下进行。3.以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小并以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：过氧化物酶活力=(△OD470nm×D)/(0.01×t)过氧化物酶比活力=(△OD470nm×D)/(0.01×t×w)t:反应时间(min);D:稀释倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。此处没有稀释，D为1。W:绿豆芽鲜重（g）3.5.2SOD酶活力测定从操作简单、迅速、精确度高、进样量小的角度考虑，本论文选择连苯三酚自氧化法[15]测定SOD酶活力测定。25C，3ml50mmol/LpH8.30的Tric-HCL缓冲液，加入10l50mmol/L连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07／min左右），迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯(应该用石英杯)中，每30秒测一次Ａ325值，自氧化速率的变化（Ａ）控制在0.07／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的Ａ’在0.035/min左右。（以上ＡＡ’的变化值不需特别严格，Ａ只要控制在0.1以下0.04以上，Ａ’变化在Ａ的约一半左右即可）一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（unit，U）。加入酶量相当的酶活力单位（unit）＝(Ａ-Ａ’)/Ａ×２比活(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）3.6酶的聚丙乙酰胺凝胶电泳1.取样品，混入等体积的50％的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。2.配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.2∶4.8，每块胶需胶液20ml。配胶后立即灌好装胶的玻璃板。待胶凝固后，切记取出玻板底部的胶条。3.加样和电泳：取样品、溴酚蓝各20ul混合后，上样到每个凝胶齿中，上、下电泳槽加电极缓冲液后在低于15℃气温中，恒压160V（每板电流约10mA）进行电泳，当溴酚蓝迁至离凝胶下端0.5—1厘米时停上电泳。电泳时间2—3小时。用长针头注射器注水法自凝胶板上取出凝胶，凝胶要完整，不能断裂。4.POD同工酶染色采用改良的联苯胺法染色[5],将完整的凝胶置于大号培养皿中，加入染色液，浸泡整块凝胶，室温下染色15—20分钟，呈现酶带后取出凝胶，用脱色液分3次脱去背景颜色，然后用水漂洗。5.SOD同工酶染色采用SOD活性法[16]：电泳后取出胶片，按次序浸泡在如下溶液：(1)2.45×10-3mol/l氮蓝四唑（NBT）黑暗下浸泡20分钟；(2)在含有2.8×10-2mol/l四甲基异乙二胺、2.8×10-5mol/l核黄素的3.6×10-2mol/lpH7.8磷酸缓冲液中黑暗下浸泡15分钟;(3)在含有1.0×10-4mol/lEDTA二钠盐的5×10-2mol/lpH7.8磷酸缓冲液于4×8W日光灯下光照20～30分钟；(4)直到蓝色背景上出现无色透明的SOD活性区带为止，经蒸馏水漂洗几次于暗处晾干。6.将凝胶拍照记录，胶凉干后还作永久保存。