外科学与分子生物学

外科学与分子生物学Surgery&molecularbiology于颖彦上海消化外科研究所Definition:是在分子水平阐述核酸与蛋白质，蛋白质与蛋白质的相互作用，阐述基因表达与调控机理的科学DNA分子双螺旋结构：goldenhelixCrick(物理学家),Watson(生物学家).Nature,19531962年荣获诺贝尔生理学与医学奖现代分子生物学诞生DNA：deoxyribonucleicacid：是具有保存、复制信息，并可在细胞与细胞之间，亲代与子代之间传递信息的生物大分子结构：两条缎带样结构盘绕成梯形双螺旋结构，呈致密线圈状存在于细胞核的染色体内。缎带结构是核糖与磷酸构成的骨架；内部阶梯是碱基对碱基对：A-T，C-GA:adenineT:thymineC:cytosineG:guanineDNA的半保留复制：子代DNA双链一条来自亲代，另一条为新合成的互补链，子链是母链的准确抄本，由此构成了遗传保守性DNA半保留复制分子生物学中心法则centraldogma：DNA指导RNA合成，RNA指导蛋白质合成，而特异性蛋白质又反过来催化DNA、RNA合成DNA的每条单链由很多字母组成：ATGCTCGAATAAATGTGAATTTGA以上字母组成多个词：ATGCTCGAATAAATGTGAATTTGA以上单词构成了句子：[ATGCTCGAATAA][ATGTGAATTTGA]以上句子就是基因基因：是负载特定遗传信息的DNA分子片段。是编码一个RNA分子所必须的DNA序列，RNA是充当DNA与蛋白质合成间的信使，DNA发布制造蛋白质（Protein）的命令基因组（genome）：构成细胞DNA的大约60亿个碱基，组成的全套基因。除了同卵双胞胎外，每个各体碱基序列均不相同，使得每一各体都有各自的特点染色体：chromosome：是基因的载体，人类体细胞含46条染色体，44条为常染色体，另两条为性染色体，在女性为XX，男性为XY突变：Mutation,即构成基因的DNA字母发生改变GenemutationGenemutation单核苷酸多态性：singlenucleotidepolymorphism,SNP即构成基因的DNA字母发生改变。与基因突变的差别在于，突变在群体中的发生频率小于1%，而多态性在群体中的出现频率大于1%Geneexpression真核生物的基因由编码序列和非编码序列组成。前者称为外显子（exon）；后者称为内含子（intron）。两者相嵌排列。内含子被切掉后外显子拼接起来转录为基因产物。每一个基因首位和末位外显子外侧均有一段不被转录与翻译的非编码区，参与转录与翻译的调控。此区含有与RNA聚合酶结合并启动基因转录的启动子（promotor），使基因高效转录的增强子（enhancer），使转录终止的终止子（terminator）Regulationofgeneexpression基因的转录调控外科分子生物学的提出•20世纪80年代•外科已能有效的控制创伤与感染•外科研究的主体转向肿瘤研究•外科的优势：最易获得人类肿瘤材料研究内容细胞增殖与凋亡Cellproliferationandapoptosis肿瘤为主要研究对象，揭示细胞周期失控的类型与机制，为分子诊断与基因治疗提供依据目标外科疾病的基因诊断与基因治疗原癌基因：protooncogene，原本存在于正常细胞中，表示C-myc癌基因：oncogene，具有使正常细胞转化为肿瘤的基因，或称transforminggene。由小写字母表示，如myc肿瘤抑制基因：tumorsupressorgene抗癌基因：antioncogene他们的失活或功能丢失，使细胞周期失去负性调控，正常细胞转变为肿瘤细胞OncogeneTumorsuppressorgeneDNA损伤：生物体的内外环境可造成DNA损伤，引起碱基序列改变或断裂，若不加以纠正，则将转录翻译出错误蛋白质，是衰老、疾病、癌症发生的原因肿瘤抑制基因功能丢失肿瘤是一类细胞周期疾病（cellcycledisease）细胞周期的调控应用：肿瘤的发病机制研究肿瘤发病机制研究：肿瘤是多步骤多基因突变的疾病基因诊断：以探测基因存在，分析基因类型和缺陷以及功能是否正常从而达到诊断疾病的方法1．核酸分子杂交根据碱基互补原则，利用核苷酸单链作为分子探针检测待测基因的过程。Southernblot;northernblot;dotblot;insituhybridization，FISH2．聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）：由DNA聚合酶催化，利用极微量DNA片段扩增，经过多个循环周而复始，使目的DNA片段达到扩增3．DNA芯片技术在固相膜片上制成成千上万个寡核苷酸点阵，以待测样本DNA、RNA用荧光标记后与之杂交，利用激光共聚焦显微镜对芯片扫描，计算机进行信息分析1．人类基因组计划：humangenomeproject,HGP由美国科学家提出，目的是将细胞内基因组DNA序列全部分析出来。美国1990年正式启动，英、法、德、日、中等国科学家共同参与，2003年4月已宣布完成人类基因组序列图后基因组计划或功能基因组学：post-genomeproject,functionalgenomics研究基因组中各基因的功能，目前已知功能的基因仅占小部分，大量基因功能尚待阐明HomogenizationPCR：polymerasechainreaction是在模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸（dNTP）存在条件下由耐热DNA聚合酶在体外酶促合成双链DNA反应。其特异性取决于引物和模板DNA的特异性PCRPCRPCRSouthernblotInsituhybridizationMicroarrayGenediagnosistechnique:microarray基因治疗：genetherapy,指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用向免疫细胞导入细胞因子基因，增强机体免疫功能。包括肿瘤坏死因子类、干扰素类、白细胞介素类（基因增补）导入主要组织相容性复合物抗原基因（MHC），提高肿瘤抗原性，诱导特异性细胞毒性杀伤作用导入抑癌基因。如野生型P53基因，诱导肿瘤凋亡并丧失致瘤性遏制癌基因的表达。采用反义核苷酸序列在癌基因表达时与mRNA特异性结合，以阻遏癌基因表达（基因封闭）导入自杀基因，将某些病毒、细菌中的前药转换酶基因——自杀基因导入癌细胞，自杀基因编码的酶类将药物前体在癌细胞内转换为毒性产物，达到杀伤肿瘤目的外科学与免疫学Surgery&immunology免疫系统的组成免疫系统，immunesystem：参与免疫应答，执行免疫功能的独立解剖学结构。包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子•Thymus,bonemarrowLymphnode,spleen，mucosaassociatedlymphoidtissue(MALT)•T、Blymphocyte,naturalkillercell,antigen-presentingcell•Immunoglobulin,complement,cytokine,adhesionmolecule，MHC(HLA)免疫系统组成免疫应答的基本机理•免疫应答是由多种免疫细胞和免疫分子参与的复杂过程，根据参与主要免疫细胞的不同分为T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答。免疫应答效应可保护机体免受抗原异物的侵害，但某种情况下也可导致自身组织的损伤•免疫应答三时相：识别相、激活相、效应相T细胞介导的细胞免疫效应机制•CD8+Tcell活化需要双信号①TCR特异性识别MHCI分子-抗原肽复合物②共刺激信号或第二信号+CD4+T细胞分泌的细胞因子••T细胞杀伤靶细胞效应细胞与靶细胞结合——杀伤①颗粒胞吐机制：穿孔素、颗粒酶、丝氨酸酯酶等②受体介导机制：Fas-FasL途径；TNF途径B细胞介导的细胞免疫效应机制巨噬细胞加工抗原B细胞识别抗原决定簇抗原肽_MHCII分子复合物（第一信号）Th细胞活化产生多种细胞因子（第二信号）B细胞增殖、分化为浆细胞，产生免疫球蛋白（antibody）MHC基因DendriticcellandtumorantigenNK细胞介导的细胞免疫效应机制特点：无须抗原刺激，无MHC限制，不依赖抗体，为自然杀伤性质识别靶细胞：与靶细胞膜结合的IgGFc段；LFA-1与靶细胞膜ICAM-1相互作用杀伤靶细胞①穿孔素、颗粒酶机制②TNF机制③NK细胞毒因子免疫记忆机制：immunologicalmemory机体对胸腺依赖性抗原再次刺激时表现出比初次刺激更为强烈的应答反应，需要T、B细胞的共同参与T细胞免疫记忆：终生存在。即初次免疫应答结束后有长寿性记忆T细胞存活，滤泡树突状细胞可持续低水平保持抗原B细胞免疫记忆：与T细胞免疫记忆相似，初次应答后有长寿性记忆B细胞存活，需要滤泡树突状细胞可持续低水平保持抗原及抗原特异性CD4+T细胞协调免疫调节：immuneregulation指机体多种因素对免疫应答过程的正负调节作用，以使免疫应答适度，维持内环境稳定例如APC表面MHC分子与黏附分子具有调节作用可溶性免疫分子具有调节作用Fas-FasL系统具有调节作用免疫调节以抗感染免疫为例•抗感染免疫是机体识别、清除病原体的生理性防御机制。免疫学基本理论是建立在感染免疫基础上•抗感染免疫特点：天然免疫和获得性免疫共存；病原体不同，免疫机制也不同；病原体可发生免疫逃避或抵抗；不恰当的免疫同样引起损伤与疾病•天然免疫：各种屏障，吞噬细胞，NK细胞，补体、细胞因子等•获得性免疫：T细胞免疫应答，B细胞免疫应答；免疫记忆（immunologicalmemory）感染的免疫效应机制感染：免疫效应机制抗感染免疫肿瘤免疫学：tumorimmunology•研究肿瘤的免疫源性、机体免疫功能与肿瘤发生发展关系、机体抗肿瘤效应机制以及免疫诊断和免疫治疗的科学•肿瘤抗原•是恶性转化细胞中出现的蛋白与多肽分子总称•肿瘤特异性抗原：tumor-specificantigen，TSA，指正常细胞不存在，肿瘤细胞所独有的抗原。如黑色素瘤抗原基因产物（melanoma-antigen-encodinggene,MEGE）•肿瘤相关抗原：tumor-associationantigen，TAA,指可存在于正常细胞或胚胎组织，肿瘤细胞表达增高，如AFP，CEA，CA19-9等TumorantigenTumorimmune抗肿瘤免疫应答:细胞免疫占主导地位；体液免疫起一定作用；NK细胞起一定作用肿瘤的免疫治疗：immunotherapy机理：提高肿瘤免疫源性；激发机体抗肿瘤免疫应答能力免疫治疗分类：主动免疫疗法：activeimmunotherapy,即激活机体抗肿瘤免疫能力，如毒或灭活瘤苗；基因修饰瘤苗；肿瘤抗原肽疫苗等被动免疫疗法：passiveimmunotherapy,即向宿主转移有抗肿瘤活性的治疗因子或细胞，如单克隆抗体；抗体偶联物；淋巴细胞，TNF等主动免疫疗法中肿瘤抗原的制备肿瘤细胞作为疫苗：加热、冻融、放射线照射等处理，使瘤细胞灭活，保持抗原性，以非特异性刺激因子作为左剂联合注射于患者体内进行主动免疫治疗抗原肽作为疫苗：生化技术纯化肿瘤细胞抗原肽或依据肽序列人工合成抗原肽，结合MHCI分子作为疫苗肿瘤免疫治疗肿瘤的免疫监视与免疫逃逸•免疫监视：immunesurveillence,指机体免疫系统可以识别并消灭表达新抗原的“异己”成分或突变细胞，保持机体内环境稳定•免疫逃逸：immuno-evasion，指机体免疫系统无法识别、消灭突变的细胞。是肿瘤进展、转移的基础•原因①肿瘤抗原性低下；MHCI类分子表达减少、缺乏②肿瘤细胞自分泌免疫抑制因子TGF-β、IL-10③宿主T细胞发育或功能缺陷④宿主血清中的封闭因子⑤免疫豁免，即肿瘤细胞表达FasL，引起CTL凋亡Transplantrejection同种异体器官移植排