大孔树脂分离纯化延胡索总生物碱的工艺研究

书书书作者简介：胡季强，男，博士，高级工程师　　Ｔｅｌ：[phone]　　Ｅｍａｉｌ：[e-mail]大孔树脂分离纯化延胡索总生物碱的工艺研究胡季强１，王如伟１，吕遷２，邱红英２（１．浙江康恩贝制药股份有限公司，杭州３１００５２；２．浙江中药与天然药物研究院，杭州３１００５２）摘要：目的　研究大孔树脂分离纯化延胡索总生物碱的工艺条件及参数。方法　以延胡索总生物碱提取率为评价指标筛选大孔树脂。结果　经试验表明分离纯化的最佳工艺为Ｄ１０１大孔树脂，上样量为延胡索药材与树脂体积比为１∶１（ｇ·ｍＬ－１）；洗脱速度０．５ＢＶ·ｈ－１；去离子水洗脱杂质，洗脱体积为６ＢＶ，８０％乙醇洗脱总生物碱，洗脱体积为６ＢＶ。结论　该工艺简单可行，分离效果好，能满足于大生产的要求。关键词：大孔树脂；分离；纯化；延胡索；总生物碱中图分类号：Ｒ２８４．２　　　文献标识码：Ｂ　　　文章编号：１００７７６９３（２００９）０４０２７１０３ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｒｏｓｓＡａｌｋａｌｏｉｄｉｎＲｈｉｚｏｍａＣｏｒｙｄａｌｉｓｗｉｔｈＭａｃｒｏｐｏｐｏｕｓＡｄｓｏｒｂｉｎｇＲｅｓｉｎＨＵＪｉｑｉａｎｇ１，ＷＡＮＧＲｕｗｅｉ１，ＬＶＳｈｅｎ２，ＱＩＵＨｏｎｇｙｉｎｇ２（１．ＺｈｅｊｉａｎｇＣｏｎｂａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５２，Ｃｈｉｎａ；２．ＺｈｅｊｉａｎｇＴｒａｄｉｔｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＮａｔｕｒａｌＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈＡｃａｄｅｍｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５２，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｇｒｏｓｓａｌｋａｌｏｉｄｉｎＲｈｉｚｏｍａＣｏｒｙｄａｌｉｓｗｉｔｈｍａｃｒｏｐｏｐｏｕｓａｄｓｏｒｂｉｎｇｒｅｓｉｎ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｙｉｅｌｄｏｆｔｈｅｇｒｏｓｓａｌｋａｌｏｉｄｗｅｒｅｔａｋｅｎａｓｉｎｄｅｘｔｏｓｅｌｅｃｔｔｈｅｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｏｐｔｉｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｉ．ｅ．Ｄ１０１ｔｙｐｅｍａｃｒｏｐｏｐｏｕｓａｄｓｏｒｂｉｎｇｒｅｓｉｎ，ａｄｓｏｒｂｉｎｇｒａｔｅｗａｓ０．５ＢＶ·ｈ－１，ｗａｔｅｒｖｏｌｕｍｅｆｏｒｒｅｍｏｖｉｎｇｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｗａｓ６ＢＶ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｔｈａｎｏｌｗａｓ８０％，ａｎｄｖｏｌｕｍｅｏｆｅｔｈａｎｏｌｗａｓ６ＢＶ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅ，ｗｉｔｈｇｏｏｄｓｅｐａｒａｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｗｈｉｃｈｃａｎｍｅｅｔｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｍａｃｒｏｐｏｐｏｕｓａｄｓｏｒｂｉｎｇｒｅｓｉｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲｈｉｚｏｍａＣｏｒｙｄａｌｉｓ；ｇｒｏｓｓａｌｋａｌｏｉｄ　　延胡索（元胡）为罂粟科植物延胡索（ＣｏｒｙｄａｌｉｓｙａｎｈｕｓｕｏＷ．Ｔ．Ｗａｎｇ）的干燥块茎，主产地浙江，为著名的浙八味之一。中国药典２００５年版收载品种［１］，具有活血、利气、止痛的作用，临床上用于胸胁、脘腹疼痛、经闭痛经、产后瘀阻、跌扑肿痛。本实验旨在优选出一种适合分离延胡索总生物碱的大孔树脂，并对优选出的大孔树脂分离延胡索总生物碱时的工艺条件及参数进行研究，研究表明，筛选出的工艺简单易行，为延胡索总生物碱的工业化生产提供切实的理论依据和条件。１　仪器与试剂紫外分光光度计：日本岛津ＵＶ２２０１；延胡索乙素对照品：中国药品生物制品检定所，批号：１１０７２６２００４０９；延胡索药材：兰溪市三江中药饮片有限公司；大孔树脂Ｄ１０１：浙江美迪康贸易公司；大孔树脂ＤＡ２０１：杭州德佳科学仪器有限公司；大孔树脂Ｘ－５、ＡＢ－８：南开大学化工厂；氯仿、溴甲酚绿、盐酸均为分析纯。树脂的物理结构参数参见表１。表１　大孔树脂的物理结构参数Ｔａｂ１　Ｔｈｅｐｈｙｓｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｂｓｏｒｂｉｎｇｒｅｓｉｎ树脂型号极性粒径范围／ｍｍ比表面积／ｍ２·ｇ－１孔径／Ａ°孔容／ｍＬ·ｇ－１Ｄ１０１非极性０．３～１．２５≥４００９０～１００１．２０～１．３５ＤＡ２０１极性　０．３～１．２５≥１５０９０～１００１．１０～１．２０Ｘ－５非极性０．３～１．２５５００～６００２９０～３００１．２０～１．２４ＡＢ－８弱极性０．３～１．２５４８０～５２０１３０～１４００．７３～０．７７２　方法与结果２．１　延胡索总生物碱含量测定方法酸性染料比色法：酸水溶解样品，以溴甲酚绿为离子对，邻苯二甲酸缓冲液为水相，氯仿为有机相提取延胡索总生物碱，与溴甲酚绿形成的呈色离子对，以延胡索乙素为对照品，比色法测定延胡索总生物·１７２·中国现代应用药学杂志２００９年４月第２６卷第４期　　　　　　　　　　　　　　　ＣｈｉｎＪＭＡＰ，２００９Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．２６Ｎｏ．４碱的含量。２．２　延胡索提取液的制备称取延胡索药材粗粉１０００ｇ，加入８０％乙醇溶液５０００ｍＬ，回流提取３ｈ，过滤，得滤液；滤渣再重复操作２次，合并３份滤液，减压浓缩至１０００ｍＬ，即得（总生物碱浓度约５．０ｍｇ·ｍＬ－１）。２．３　大孔树脂预处理将大孔树脂用９５％的乙醇浸泡２４ｈ，使其充分膨胀，湿法装柱，然后用９５％的乙醇液洗至流出液加适量纯水无白色浑浊现象，再用去离子水洗净乙醇，直至流出液无浑浊为止。２．４　树脂型号的筛选将延胡索提取液平均分成４份，分别加入４种型号的大孔树脂（Ｄ１０１、ＤＡ２０１、Ｘ５、ＡＢ８）中，依次用纯水和８０％乙醇进行洗脱，计算延胡索总生物碱的提取率（解析后所得的总生物碱量与上柱前提取液中总生物碱量的比值），实验结果见表２。表２　不同型号大孔树脂的筛选结果（ｎ＝２）Ｔａｂ２　Ｓｅｌｅｃｔｅｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｂｓｏｒｂｉｎｇｒｅｓｉｎ（ｎ＝２）树脂类型延胡索总生物碱提取率／％Ｄ１０１８４．２ＤＡ２０１７９．４Ｘ－５７３．２ＡＢ－８７６．７　　由上述试验结果可知，Ｄ１０１大孔树脂分离纯化延胡索总生物碱提取率较高，故确定选用Ｄ１０１型大孔树脂。２．５　Ｄ１０１大孔树脂对延胡索总生物碱的动态吸附性能及上样量的确定为了考察Ｄ１０１大孔树脂对延胡索总生物碱的动态吸附性能，确定Ｄ１０１大孔树脂的样品处理量，进行泄漏曲线的测定。取延胡索提取液（总生物碱浓度以延胡索乙素计为５．０ｍｇ·ｍＬ－１），加入Ｄ１０１大孔树脂中，大孔树脂体积为１０ｍＬ，流速控制０．５ＢＶ·ｈ－１，分段收集，每收集１０ｍＬ立即测定吸光度，共收集３００ｍＬ，以药液吸附流出体积为横坐标（Ｘ轴），以流出液总生物碱测定量为纵坐标（Ｙ轴）绘制泄漏曲线，从而确定Ｄ１０１大孔树脂的样品处理量，见图１。　　上述试验结果表明，Ｄ１０１大孔树脂对延胡索总生物碱的吸附容量，当流速为０．５ＢＶ·ｈ－１，最大可以处理３倍柱床体积总生物碱浓度为５．０ｍｇ·ｍＬ－１（以延胡索乙素计）的延胡索提取液不发图１　Ｄ１０１树脂吸附总生物碱的泄漏曲线Ｆｉｇ１　ＴｈｅｌｅａｋａｇｅｃｕｒｖｅｏｆＭａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎＤ１０１ａｂｓｏｒｂｉｎｇｔｈｅｇｒｏｓｓａｌｋａｌｏｉｄ生泄漏。综合考虑选用延胡索药材与树脂用量（柱体积）比约为１∶１（ｇ·ｍＬ－１）上样，以保证绝对不发生泄漏。２．６　杂质洗脱剂的选择及用量的确定取３根相同型号的玻璃层析柱，按“２．５”项确定的的方法上样，分别以１０％乙醇溶液、稀盐酸（ｐＨ５）、去离子水进行洗脱，每１ＢＶ接收１份，紫外检测总生物碱的含量，同时观察洗脱液的颜色，确定洗脱剂的用量，结果见表３。表３　３种杂质洗脱剂总生物碱含量／ｍｇ·ｍＬ－１Ｔａｂ３　Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｇｒｏｓｓａｌｋａｌｏｉｄｕｓｉｎｇｔｈｒｅｅｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｅｌｕｅｎｔ／ｍｇ·ｍＬ－１序号１０％乙醇稀盐酸去离子水１０．０６０．１１０２０．０７０．２１０３０．０９０．０９０４０．１１０．２２０５０．０９０．１１０６０．１１０．１５０　　上述试验结果表明，１０％乙醇及稀盐酸洗脱杂质时，总生物碱都有部分损失，而去离子水洗脱却能保证生物碱不被洗脱下来，所以选定去离子水为杂质洗脱剂。通过观察去离子水洗脱到５个柱体积后，洗脱液颜色已很浅，水溶性杂质基本上已经洗掉，确定杂质洗脱剂用量为５个柱体积。２．７　总生物碱洗脱剂种类与用量的筛选取３根相同型号的玻璃层析柱，按“２．５”项及“２．６”项确定的方法上样并洗脱杂质，分别以５０％乙醇、８０％乙醇和９５％乙醇洗脱吸附在层析柱上的延胡索总生物碱，每１ＢＶ接收１份，紫外检测总生物碱的含量，以洗脱液中总生物碱含量为指标，确定洗脱剂及用量。·２７２·ＣｈｉｎＪＭＡＰ，２００９Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．２６Ｎｏ．４　　　　　　　　　　　　　　　中国现代应用药学杂志２００９年４月第２６卷第４期表４　不同乙醇浓度对总生物碱含量的影响／ｍｇ·ｍＬ－１Ｔａｂ４　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｒｏｓｓａｌｋａｌｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔ／ｍｇ·ｍＬ－１序号５０％乙醇８０％乙醇９５％乙醇１０．２１０．９１０．５７２０．５２１．２１０．７５３０．５５１．２３０．８７４０．７２０．５６０．８８５０．４１０．０２０．２９６０．４４０．０１０．０３　　上述试验结果表明，洗脱５个柱体积时，８０％乙醇总生物碱含量已经很低，５０％乙醇和９５％乙醇仍含有一定量总生物碱，考虑到成本，确定总生物碱洗脱剂为８０％乙醇，洗脱体积为５个柱体积。２．８　总生物碱样品的制备及检验延胡索药材１ｋｇ，制备得样品６．５３ｇ，含总生物碱７２．８％，该工艺能保证中药新药口服制剂对有效部位含量的要求（大于５０％）。为保证工艺可控，延胡索药材投料前应进行检验，本试验中采用的延胡索药材总生物碱含量为１．２％。３　讨论本试验针对延胡索总生物碱分离纯化工艺进行研究，４种大孔树脂中，Ｄ１０１树脂最适合分离延胡索总生物碱，上样量为延胡索药材与树脂体积比为１∶１（ｇ·ｍＬ－１），洗脱速度０．５ＢＶ·ｈ－１，去离子水洗脱杂质效果理想，洗脱体积为６个柱体积，采用８０％乙醇洗脱总生物碱，洗脱体积为５个柱体积。大孔树脂广泛应用于中药的分离纯化［２５］，在使用时，应根据药物的有效成分的理化性质进行树脂型号、吸附容量、洗脱分离等具体工艺条件进行考察。采用本试验确定的工艺，可以保证总生物碱含量在５０％以上，符合中药新药口服制剂对有效部位含量的要求。该工艺分离纯化延胡索总生物碱具有工艺成熟、操作简便、成本低、产率高的特点，有良好的实际应用前景。ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ［１］Ｃｈ．Ｐ（２００５）ＶｏｌⅠ（中国药典２００５年版．一部）［Ｓ］．２００５：９４．［２］ＨＵＡＮＧＪＭ，ＧＵＯＪＸ，ＣＨＥＮＷＳ，ｅｔａｌ．ＡｄｓｏｒｐｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｆｏｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎＡｃｏｎｉｔｕｍＫｕｓｎｅｚｏｆｆｉｉ［Ｊ］．ＪＦｕｄａｎＵｎｉｖＭｅｄＳｃｉ（复旦大学学报医学版），２００３，３０（３）：２６７２６９．［３］ＨＵＪ，ＺＨＯＵＹＨ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｉｎｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎＴｒａｄｉｔＰａｔＭｅｄ（中成药），２００２，２４（２）：１２７１３０．［４］ＺＨＡＮＧＨ，ＬＩＵＺＱ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｄｓｏｒｂｉｎｇｒｅｓｉｎｓｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｈｉ