SSR分子标记在杂交稻种子纯度精确鉴定中的应用

11SSR分子标记在杂交稻种子纯度精确鉴定中的应用郭承亮(湖北省种子集团有限公司武汉430602）摘要：传统的田间小区种植纯度鉴定方法由于时间滞后不能满足种子企业的需求，而现有的SSR标记检测杂交水稻种子纯度的方法，虽能有效鉴定出杂交种的父、母本，但不能将一些混杂的杂株、串粉所致的杂交种区分开，也无法满足种子企业的全面质量信息需求。本文结合自身工作实践，介绍了一种利用筛选的多对SSR分子标记深入检测杂交水稻种子纯度及开展杂株类型定量鉴定的方法，这种方法不仅能更精确的检测杂交水稻种子纯度，还能将种子所含的杂株类型及其各自占比鉴定出来，为种子企业提供更准确、更全面的质量信息和可操作性强的加工处理办法。本方法广泛适用于各种子企业对主营骨干水稻品种的质量监控和生产经营决策。关键词：SSR分子标记纯度鉴定杂株类型定量鉴定纯度是种子质量的核心指标，既是种子企业生存的根本，也是企业种子加工、销售决策的关键依据。种子纯度检测主要有海南种植鉴定（以下简称“南鉴”）、正季种植鉴定（以下简称“正鉴”）以及SSR分子标记鉴定等方法。这三种方法各有特点：南鉴和正鉴是以田间小区种植方式，从植株的典型特性判别、鉴定种子纯度。南鉴具有鉴定相对准确、时间相对提前的优点，但海南冬季属短日低温条件，感光类型及两系不育系均表现为正常结实，对杂交稻尤其是两系杂交稻种子纯度的鉴定结果往往失真；正鉴具有鉴定准确、鉴定结果与大田生产实际吻合度高的优点，但时间明显滞后。从历年发生的重大种子纯度事故来看，绝大多数是在得知种子纯度不合格之前种子已经销售到千家万户无法召回，最终酿成无法挽回的损失。SSR分子标记是从DNA水平上检测生物个体差异，具有多态性高、谱带扩增稳定、技术成熟、检测时间短、不受环境影响等特点，在杂交水稻种子纯度鉴1郭承亮，男，(1982-)，湖北黄冈人，硕士研究生，毕业于华中农业大学，现主要从事种子质量检测和分子标记辅助育种等研究。E-mail：[e-mail]。2定研究中得到了越来越广泛的应用[1]。本文详细介绍了SSR分子标记在杂交稻种子纯度及杂株类型定量鉴定中的应用，为种子企业在杂交稻种子纯度的检测上提供更精确的鉴定方法。1SSR分子标记的原理、特点及在杂交水稻纯度鉴定中的应用现状1.1SSR分子标记的原理SSR也称为微卫星DNA(microsatelliteDNA)、短串联重复(tendom-repeats)或简单序列长度多态性(simplesequencelengthporlymorphism)，它通常是指基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA,广泛分布于基因组的不同位置,长度一般在200bp以下,相同座位上的重复序列由于重复次数不同而产生了等位基因的多态性，SSR引物就是根据这些区域串连数目的差异造成的多态性设计而成的[2-5]。1.2SSR分子标记的特点SSR分子标记广泛、随机、均匀分布于作物基因组，参与遗传物质结构的改变、基因调控等过程，直接反映种子遗传物质在DNA水平上的差异。具有以下几个特点：1、准确性高、数量丰富，覆盖整个基因组，提供的信息量高；2、多态性好，多数SSR序列无功能作用,增加或减少几个重复序列的频率高,因而在品种间具广泛位点变异,多态性强；3、重复性好,使用简单,结果稳定；4、SSR标记两侧的序列具有高度的保守性,它使我们可以在一个物种的微卫星研究中利用另一物种的研究结果,从而更快更准确地找到该物种中更多的SSR位点，每个位点由设计的引物顺序决定，便于相互交流、合作开发引物；5、属共显性遗传，符合孟德尔式遗传定律，不易被自然选择和人工选择所淘汰；6、易于利用PCR技术分析，分析简便,所需DNA样品量少，3仅需微量组织就能进行有效地分析鉴定，经济简便；7、不受季节、环境的影响，并且鉴定的时间快。1.3SSR标记在杂交稻纯度鉴定上的应用现状彭锁堂等[2]选用分布于水稻12条染色体上的26对引物对9个杂交稻组合及其亲本进行了SSR分析,能够有效地区分所有的恢复系和大部分不育系,并对杂交稻组合汕优63和两优培九进行了单粒种子SSR鉴定,所测纯度与田间种植鉴定纯度非常接近,认为SSR标记适合于杂交水稻种子纯度鉴定；辛业芸等[3]应用SSR分子标记技术对5个超级杂交稻组合及其9个亲本进行鉴定,找到在杂交稻组合及其亲本间具有多态性的引物,筛选出5对引物分别作为鉴定这5个超级杂交稻组合的特异引物；詹庆才等[4-5]利用多态性好的两对SSR标记引物分别对参试的威优46和金优207进行了纯度鉴定,能有效地将掺假的种子与真种子区分开；通过进一步研究，优化了利用SSR分子标记快速鉴定杂交水稻种子纯度的技术体系,缩短了检测时间，推进了该技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用。当前，SSR分子标记技术已广泛应用于杂交水稻种子纯度鉴定,种子企业利用该技术为杂交水稻种子的安全生产、安全推广服务，各级种子管理部门利用该技术进行市场监督和质量监控。2SSR分子标记在杂交水稻种子纯度鉴定中存在的问题2.1单个SSR标记难以准确鉴定杂交水稻种子纯度。目前，一般利用单个SSR分子标记检测杂交水稻种子纯度，由于单个标记的局限性：能有效的将杂交种的父、母本鉴定出来，但不能将一些混杂的杂株以及一些异源花粉造成的杂交种区分开。郭承亮等[6]在利用SSR标记RM21对两优287正季小区鉴定田间调查出的十种杂4株类型的特异性进行了验证，发现所选择的SSR分子标记只能区分其中6种杂株类型，对其它4种类型的杂株则不能区分。近几年来，因推广含有表现型明显、比例较高的某一类型杂株（比如：青稞等）但事实上并未超标的杂交稻种子，严重影响该种子企业的信誉，甚至引发群体性事件的案例时有发生。由于这种类型的杂株（如：青稞等）一般都是由串粉引起的，单个标记不能有效的将它鉴别出来，即使有时能够鉴别，但不能精确鉴定其所占比例。2.2单个SSR标记鉴定杂交水稻种子纯度的客观误差影响了对种子批真实质量状况的判定。郭承亮等[6]在利用SSR标记RM21和田间小区鉴定调查鉴定了30份两优287杂交稻材料的纯度，研究发现：就每份样品而言，SSR标记鉴定的纯度与田间种植鉴定的纯度结果差异在1.5个百分点。我国的杂交稻种子纯度（国标二级）标准为96.0%，根据《农作物种子检验规程》(GB/T3543·5-1995)中表16-2品种纯度的容许差距规定：当检测的杂交水稻种子样本数为200粒时，其允许误差为2.3。而在种子执法时，只要纯度低于96.0%就属于劣种，执法部门就可以对其予以重罚，这为种子企业在参考SSR标记检测的纯度结果，做出具体的经营决策带来了很大困难，甚至可能会给该企业造成本可规避的巨大损失。2.3单个SSR标记鉴定杂交水稻种子纯度不能对种子批大田种植的纯度表现作出科学预判。在研究中，还发现两优287品种中的父本杂株R287在正季种植鉴定中田间表现不明显。通过单个标记鉴定的结果，不能准确地预判其正季种植的大田表现。因此，通过单个标记鉴定种子纯度，只能大致5了解种子纯度状况，不能全面准确判断种子的质量信息，给种子企业的生产、经营带来一定的风险。3SSR标记在杂交稻种子纯度及杂株类型定量鉴定中的技术要点及应用实例3.1技术要点DNA提取参照传统的CTAB法或简化的DNA提取法[4-5]，PCR反应程序参照行业标准NY/T1433-2007《水稻品种鉴定DNA指纹方法》，PCR反应产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。3.2技术路线3.3应用实例湖北省种子集团有限公司郭承亮等[7]利用24对SSR标记对两优287田间正季鉴定中的9种主要杂株类型的部分植株进行特异性分析，最终筛选出可将杂株类型相对区分开的3对SSR标记RM71、RM19、RM224，利用这3对SSR标记对正季鉴定中的同一份样本1920正季种植鉴定杂株类型调查、选取取叶片、提DNA多对SSR标记检测杂株类型定性分析、根据需要选取SSR标记组合样品登记SSR检测、杂株定量分析正季种植鉴定统计结果统计结果差异性分析、统计差异结果、归档6粒种子进行分析，鉴定出的种子纯度及所含杂株类型比例与大田正季鉴定中的结果基本吻合，各种杂株类型的分布基本一致。并利用这3对SSR标记对所有的正季种植鉴定中的杂株进行了差异性分析，研究发现：1、通过这3对标记可以有效鉴定出所有表现型的杂株；2、在利用SSR标记定量鉴定中，归为其它类型杂株的，都能在杂株差异性分析中找出其基因型原型；3、在利用SSR标记定量鉴定中归为其他类型杂株的，各个基地都有其规律，并与种子生产基地的实际相符：如湖南基地多为迟熟株（串粉所致）、公安基地多为早熟株（落地谷）。同时，还将该技术推广应用到广两优558的杂株类型定量鉴定中，由于广两优558的江苏制种基地隔离条件很好，所以其所含的杂株仅为亲本中的杂株及串粉的杂交种，经过筛选，仅选取2对SSR标记RM224、RM85就能有效的鉴别出早熟型杂株和父本、迟熟类型杂株、不育系这三类杂株，其结果与正季种植鉴定的结果基本一致。根据实践证明，采用经过筛选的多对SSR分子标记，可以有效的鉴别各种杂株类型所占的比例，特别是能精确鉴定种子批中固定类型杂株（如父、母本）所占的比例。经过三年的实验，系统比较了两种方法的鉴定结果，分析了检测结果的差异性，建立了各个生产基地的SSR分子标记鉴定种子纯度及杂株类型定量鉴定的档案。通过对比分析，准确掌握了各制种基地的杂交水稻种子纯度信息，为公司杂交水稻种子的生产、加工、混样、推广提供准确的质量信息。4SSR分子标记在杂交稻种子纯度及杂株类型定量鉴定中需要注意的几个问题4.1鉴定所需样本大小杂交水稻种子纯度鉴定样本的大小,直接关系到SSR分子标记技7术的检测成本和检测效率，样本越大，结果越精确。根据近年来笔者大量检测实践,在杂株类型定量的研究中，由于种子样本所代表的种子批数量一般较大，一般选取1000粒种子检测，效果较好；对于特殊情况的或是种子批数量特别大的选取2000粒种子检测，可保证检测结果的准确性。对于条件不足的企业，选取一个正季小区种植鉴定的种子数500粒也可以。4.2鉴定时杂株的选取及所需标记的选取在小区种植鉴定田，通过对主要杂株类型的田间观察，每种杂株类型选取5-10株作为代表，有条件的可以选取所有杂株。杂株取样完成后，先利用农业行业标准品种鉴定推荐的24对SSR引物对这些杂株进行检测，通过对比、归类、统计分析，如这24对引物满足不了需求，可再选择其他常用的纯度检测的引物进行检测，最终选取3-5对能将各杂株类型相对区分开的SSR标记组合进行种子纯度及杂株类型定量鉴定。4.3鉴定需与种子生产相结合尽管杂交水稻种子基地生产模式多样化，甚至涉及到千家万户，但就杂交稻种子纯度这一质量指标而言，各制种基地都有明显的特点——各基地的杂交稻种子所含杂株的类型及比例都不同，但也具有规律性。因此，利用SSR标记在杂交稻种子纯度及杂株类型定量鉴定中，需与种子生产实际相结合。各企业需结合自己公司的实际情况，尤其是具体的品种和基地情况来进行分类，通过SSR鉴定与正季种植鉴定的对比分析，分析并找出差异性的原因，并归类建档，通过2-3年的研究，找出各基地的规律。5小结8传统的种植鉴定方法虽具有鉴定准确的优点，但时间明显滞后，不能满足种子企业生产经营的需求。现有的利用SSR标记检测杂交水稻种子纯度的办法，虽然可以大致预测杂交水稻种子的纯度，但面对复杂的生产环节，不能精确全面的反映种子质量信息，仍不能满足生产经营的需求。而通过筛选后的SSR分子标记组合不仅能精确的检测杂交水稻种子纯度，还能将种子所含的杂株类型和所占的比例鉴定出来，能够为种子企业提供更准确的种子质量信息和更细致的、可操作性强的加工、混样办法，为种子企业的生产经营“保驾护航”。本方法广泛适用于各种子企业对主营骨干水稻品种的质量监控和生产经营决策。参考文献：[1]李稳香,詹庆才.杂交水稻种子纯度SSR指纹图谱标记鉴定技术研究[J].中国种业.2006,3:21-22.[2]彭锁堂,庄杰云,颜启佳,等.我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴