Structureandfunction

摘要：微观型的O2和NO3被用来测定硝化生物膜滴滤池的水产养殖水再循环系统。通过使用新开发的生物传感器测定NO3,可以避免来自其它离子的传统干扰。硝化作用被限制在膜上部50um的一个狭窄的区域。在同一生物膜,垂直分布的自养型培养皿氨氧化亚硝化单胞菌属和亚硝酸盐氧化硝化菌属的数量被调查，应用整个固定细胞的荧光原位杂交16SrRNA目标寡核苷酸探针结合共焦激光扫描显微镜。氨氧化菌形成一层致密的细胞集群在生物膜的上部,而亚硝酸盐氧化菌出现在密度较低总量在亚硝化单胞菌集群的附近。两个物种在生物膜的含氧区域没有限制,但也在缺氧层大体检测到少量，甚至偶尔在生物膜的底部检测到。正文：Lithoautotrophic硝化是一个两步的过程,氨,亚硝酸盐氧化细菌的共同作用导致NH3通过NO2变换成NO3。它会导致土壤中肥料氮的重大损失和地表水和地下水的硝酸盐污染。另一方面,硝化作用是通过反硝化作用去除污水中总氮的初始步骤。因此重要的是要防止接收水域富营养化或至少在脱氮失败时能避免接收水域的铵盐污染这些污染对大部分鱼类是有毒的。因此过去的十年越来越多的关注放在硝化细菌的生理机能和生态学上。属亚硝化单胞菌和硝化菌属仍然是两个各自的步骤中两个最有名的催化剂,但最近对硝化作用的研究导致新物种的隔离,并意外发现的代谢步骤。各种测定硝化作用速率的技术已经开发出来,例如通过使用硝化抑制剂、N15稀释技术或同位素配对。然而,测定硝化作用和硝化细菌的精确定位仍然困难。氨和亚硝酸盐氧化细菌是挑剔细菌的典型例子。他们是缓慢增长的细菌而且很难用相关培养法列举。因此,应用原位识别方法评估。首先,使用荧光探测技术来检测，用显微镜对硝化细菌计数。然而,由于大量氨氧化菌的血清多样性和非特异性荧光抗体绑定的胞外聚合物物质,这些方法并不完全令人满意。最近,分子生态学的进展使得荧光原位杂交成功将16srRNA-targeted寡核苷酸探针应用在更复杂的环境中。在这个背景下，瓦格纳等人特别为亚硝化单胞菌属中耐盐和嗜盐的的成员设计一个探针，并成功地应用在检测活性污泥中的氨氧化细菌。此外,两个探针特别为硝化菌属中所有迄今有的顺序的物种已经开发出来。一个新的,非常强大的复杂群落结构的原位分析技术的引进的同时微电极也引入在微生物生态学领域。传感器使得现在在一定规模上监测多种新陈代谢反应成为可能，这些相关于分层细菌群体的研究。氮循环的监测,一氧化二氮,氨、硝酸盐的微型传感器被开发并用于调查不同的栖息地。尽管HCO3对NO3传感器的应用尤其干扰,詹森等人的工作提供有价值的信息在硝化活性的分层和调节氧和氨的影响。伴随着最近开发的硝酸盐生物传感器,然而,现在避免干扰离子的限制成为可能。在这项研究中,我们首次结合微断面的硝化活性和硝化细菌在生物膜上的微观分布的数据。荧光寡核苷酸探测已经应用于生物膜研究好几次了。在研究硫酸盐还原菌(SRB)滴滤池生物膜,公羊等使用这种技术将SRB的分布与氧的微表面,硫化物和pH值相关联。当前的研究完成用另一个滴滤池生物膜处理鳗鱼养殖的废水。硝化细菌的增长是由这个系统中高浓度的氨和约为25度的稳定温度支持的。化学梯度和细菌分层之间的关系被描述,硝化细菌在厌氧区发生的可能原因被讨论。材料和方法生物膜样品:生物膜生长在塑料箔,垂直位置位于滴滤池的底部。过滤器安装在生产鳗鱼的水产养殖的水循环中。浸湿生物膜的水中长期含有各种但高浓度的NH4(0.3至7mM)和NO3(27至39mM)，NO2和N2O的值分别是0.7至11mM和0.2至0.9mM。整个培养都放置在一个封闭的黑暗的房间里,使其保持20度到28度之间一个稳定的温度。3到4个月后,生物膜已达到约200毫米的厚度。所有的分析在箔片被移除并带到实验室浸没在原位水中进行。微电极：Clark-type氧微电极90%的反应时间小于1秒和可以忽略的活跃的敏感性被用来确定在25到50微米的深度的O2梯度。为了以类似的高分辨率测量NO3情况，一个新开发的生物传感器被使用。它是基于固定化反硝化细菌将NO3只转变为N2O而不是N2。通过将细菌放在电化学的一氧化二氮微传感器前的毛细管中,一氧化二氮的电极信号与硝酸根的浓度成正比。尺寸优化后,生物传感器给出一个线性的响应从0到300微米NO3,90%的反应时间大约20秒。探测限制大约是3微米NO3。唯一的干扰物质是NO2和N2O,它们被当做NO3测量大约分别是其两倍。因此，用化学分析法检查NO2和一氧化二氮的产品和对O2和一氧化二氮使用先前描述的组合微传感器是有必要的。测量装置：一旦取样后,生物膜被转移到一个覆盖的含有原位气泡水的玻璃箱中保存在室温22度下,O2情况如前所述被测量。两点校准电极的制作是用100%O2饱和大体积的水和底部缺氧的膜。生物膜底部的零读数与N2沸腾水的读数相同。然后,我们改变原位水成为除自来水,将NH4添加到浓度为300微米。我们假设一个新的稳态情况下10分钟后到达。水交换是必要的,因为非常高浓度的N化合物在鳗鱼农场的水中。大约30微米的NO3的背景值对于准确测定因为生物膜的硝化活动导致微摩尔范围内的浓度变化太高了。NO3的情况被测量用和O2同样的方式,但是两点校准电极被应用每三个或四个情况，分别对应的水介质生中不含或含100微米NO3。为了确保相等的温度,测量装置由水浴标准溶液担任。一氧化二氮传感器的校准是由确定数量的N2O饱和水添加到孵化水中和使用韦斯和Price报道的数值一氧化二氮溶解度。当孵化水中氧气只是半饱和状态时O2和NO3的情况也需要被记录。O2浓度调整通过大气和氮气1:1混合的气体冲洗水，O2浓度由O2传感器控制。在减少氧气下培养时间大约是4h。在所有测量中,微电极安装在计算机控制,电机驱动的显微操纵器上,生物膜的电极头的进入是用解剖显微镜监控的。数据采集是由一个个人电脑上定制的程序自动完成的。计算：耗氧量由O2作为通量,J,通过扩散边界层来决定,然而硝化作用总速率计算从NO3作为完整的通量,J,远离NO3产品层。净通量的计算通过Fick的第一扩散定律：，C（x）是深度为x时的溶解物的浓度。Ds是表面扩散系数，φ是空隙率。我们使用表格值2.24·10-5cm2s-1和1.9·10-5cm2s-1分别作为在水温22摄氏度时O2和NO3的扩散系数。根据Revsbech和Glud等人用生物膜和微生物垫测量Ds·φ，在生物膜中的扩散系数被假定低于水中的40%。化学分析：在分析过重新计算的NO3与NO2的比值后，水样被从滴滤池和测量装置中取出。样品被储存在零下20摄氏度直到图像光谱测量分析铵根、亚硝酸根和硝酸根。为了测量一氧化二氮，一个有电子捕捉探针的日本岛津公司的GC-14A气体色谱仪被使用。生物膜的固定和切片：一旦经过微电极的测量，生物膜的样品将被固定在4摄氏度下准备好的新鲜多聚甲醛中一小时，随后用磷酸盐缓冲盐水冲洗。然后，样品生物膜的一边被嵌入OCT化合物中，被放在蒸发溶液N2上。当凝固时，通过轻微的弯曲结构下层生物膜从塑料薄膜被移除。随后生物膜被内嵌于底部再次凝固。为了阻止样品融化，最后一步正站在零下20摄氏度的低温恒温器中进行。在这个仪器中，10到20微米厚的垂直冷冻超薄切片被切除。截面以明胶覆盖微观切片被放置在六个杂交井中的五个里，并用风干和50%、80%及96%的乙醇脱水来固定。切片被储存在室温下只要几个星期。参考单元:不同已知细菌菌株的混合物被储存在最后的显微镜切片，作为杂交效率的内部控制。以下菌种的混合物被使用：亚硝化单胞菌、硝化菌属、睾丸酮丛毛单胞菌、慢生型大豆根瘤菌。寡核苷酸探针：以下rRNA目标寡核苷酸被使用(序列和靶位点,请参见表1)。（1）EUB338,一般探针互补所有细菌的16srRNA的区域作为杂交效率的积极控制。（2）NEU23a，一些自养氨氧化细菌的16SrRNA作为一个特定区域的探针最近被Wagneretal.描述。（3）NIT2andNIT3，所有迄今测序的硝化菌属菌种的16SrRNA作为一个特定区域的探针。（4）CNIT3,一个未标记的竞争者当被同时应用确保探针NIT3的特异性。（5）因此,与探针EUB338互为补充的NON338负控制探针,应该不能与细菌的rRNA杂交。寡核苷酸被合成,用荧光染料标记5，（6）荧光素羟基丁二酰亚胺酯和5,(6)-羧基四甲基琥珀酰亚胺酯琥珀酰亚胺酯,亲水性sulphoindocyanine染料CY3,净化如前所述。原位杂交：对于细胞膜选择的整个细胞杂交，这个由Manzetal.描述的协议被使用。甲酰胺被加入的最终浓度被列入表格1中确保最理想的杂交严密性。所有的杂交在46摄氏度的温度下进行，潜伏期是3小时。一个严格的冲洗步骤在48摄氏度下一个含有20毫升Tris盐酸、0.01%十二烷基硫酸钠和NaCl其浓度列在表格1中的缓冲器中进行10分钟。显微镜：生物选择用荧光显微镜检验蔡司过滤器09和15和过滤器CY3-HQ。拍摄彩色显微图用柯达EktachromeP1600颜色反转胶片。相位对比显微图曝光时间是0.01秒，荧光显微镜图是10到20秒。蔡司LSM410共焦激光扫描显微镜装备有氩离子激光和氦氖激光，被用作记录光学切片由Wagneretal.描述。结果显微梯度:所有用饱和O2的水测量的O2分布都展现出一个O2的减少在扩散边界层270微米的重力水中下降到生物膜表面的20到60微米。扩散边界层的厚度变化在150到250微米因为异样生物膜结构有突出的茸毛。O2渗透大约100微米进入生物膜中，波动在50到150微米。两个典型深度的情况展示在图形A和B中。为了说明NO3微观形，应该考虑到NO2和N2O也被生物传感器检测。因此在潜伏和分析后，NO2和重力水NO3一起被化学确定。NO2总计值和NO3的30%一样多。由于高的百分比，这种情况应该被考虑是NO3和NO2组合的情况。测量的N2O的情况略有增长N2O的浓度在重力水中由0增加到最大4微米在大约150到200微米处。N2O的影响在测量情况中减去，导致结合的NO3加上NO2展示出一个明显的最高峰在表面下，表明了一个高的硝化活性。在生物膜的更深层，NO3加上NO2浓度通常减少但从未达到0，表明生物膜大体上反硝化作用低于硝化速率。速率计算：O2消耗发生在生物膜上部50到100微米，以0.81±0.13umol.cm-2.h-1的速率。产物NO3加NO2出现在同一层里，以0.73±0.18umol.cm-2.h-1的速率.化学计量的，1mol的NO2或者NO3分别消耗1.5或者2mol的O2，因此如果30%的NO3加入NO2池是NO2，只有硝化作用时我们希望一个O2消耗大约1.2umol.cm-2.h-1。计算的硝化作用需要的O2的量和从O2情况计算的O2通量的矛盾稍后将被讨论。在层下150微米的反硝化作用速率从0到0.28umol.cm-2.h-1，平均值为0.11umol.cm-2.h-1。原水位测量：为了检查我们是否急剧地改变了生物膜的新陈代谢，用加入氮盐的自来水代替含有有机物质的原位水，我们测量替换前后的O2情况。O2深度穿透力没有改变很多，但是原位水在扩散边界层的较陡浓度梯度显示出减少在异养活性中。在30%的氧摄取中的转移通常会导致氧穿透力的一个实质的改变，但是穿透力在应用的生物膜中很肤浅以至于这种改变被时间和空间的不均匀性掩盖。硝化菌的原位探测：一个极其严密层的氨氧化细菌能用NEU23a探针检测到通过需氧的部分，很小一簇也能被发现在生物膜的更深层。它们形成特有的集合体作为亚硝化单胞菌种，就像之前在其他栖息地看到的一样。此外，硝化菌属在生物膜中检测到。可靠的可视化需要同时使用探针NIT2和NIT3两种探针。这个聚集地比亚硝化单胞菌集群的密度低，发现的数量比主要的氨氧化菌少。这种亚硝化盐氧化种群的最大值在需氧的硝化作用区域,但是某个单个细胞和聚居地仍然存在在缺氧层的上部。甚至偶尔在膜的下部。通常硝化菌属聚居地和细胞比氨氧化细菌更均匀的分布。在有氧的区域，用共焦激光扫描显微镜调查揭露氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的紧密共存，支持从氨到亚硝酸盐的