γ-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控

ZJNSF浙江省自然科学基金申请书(2005版)第1页申请书版本号：88000186同行评议组别农业微生物学项目编号Y305236浙江省自然科学基金申请书申报类别:一般项目项目名称:γ-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控申请者:阮红电话:[phone]依托单位:浙江大学城市学院通信地址:杭州市湖州街50号浙江大学城市学院生命科学分院邮政编码:310015E-mail:[e-mail]申报日期:2005-5-25浙江省自然科学基金委员会二OO五年制ZJNSF浙江省自然科学基金申请书(2005版)第2页申请书版本号：88000186基本信息申请者信息姓名阮红性别女出生日期1968年05月15日最终学位博士获学位年份2000职称副教授主要研究领域微生物基因代谢调控机理研究[e-mail]电话[phone]个人网页依托单位浙江大学城市学院证件类型身份证证件号码330622196805150087申请者是否近三年调入在浙单位工作是调入时间2004年08月申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号:申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限:项目基本信息项目名称γ-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控申报类别一般项目研究属性前瞻性应用基础研究同行评议组别农业科学及生物技术/农业微生物学依托基地名称浙江省细胞与基因工程重点实验室---浙江大学预计研究年限2006年01月－2007年12月总经费预算10.0万元申请经费10.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字)本项目围绕2005年浙江省自然科学基金申请指南第(12)项农业资源产业生物技术研究方向中提及“食品、功能与药用物质发酵生产所需的高效工程菌”重点问题立项展开研究，意在采用基因过量表达和基因整合手段，将γ-聚谷氨酸生产过程中的关键合成酶复合体基因pgsBCA导入谷氨酸棒杆菌优质的谷氨酸高产菌种中，构建γ-聚谷氨酸高效工程菌株，以期实现谷氨酸棒杆菌中的γ-聚谷氨酸高效表达，寻找基因工程技术对γ-聚谷氨酸合成的有效调整作用。令人鼓舞的是，γ-聚谷氨酸高效工程菌株构建研究意向，还得到了省内氨基酸生产行业知名企业的高度关注，厂方予以大力支持并配合我们展开科研工作，并提供我们高谷氨酸产量的谷氨酸棒杆菌优质菌种协助进行科技攻关。该项目启动将是省内氨基酸生产领域的一个新的亮点，必将为省内氨基酸企业实现γ-聚谷氨酸发酵的产业化奠定重要基础，具有深远的理论意义和现实意义。关键词（不超过4个）γ-聚谷氨酸高效工程菌株;pgsBCA;谷氨酸棒杆菌同行评议分组说明微生物生理与生物化学重点资助方向农业资源产业生物技术研究ZJNSF浙江省自然科学基金申请书(2005版)第3页申请书版本号：88000186项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（（(月)1阮红1968年05月15日女副教授博士浙江大学城市学院0571-88015081负责人72范立梅1965.05.05女副教授硕士浙江大学城市学院0571-88015081基因表达和整合63蒋立娣1968.07.24女实验员学士浙江大学城市学院0571-88015081发酵产物分析64周鹏1978.03.21男硕士生学士浙江大学生命科学学院0571-88015081基因表达和调控105李永亮1979.12.11男硕士生学士浙江大学生命科学学院0571-88015081发酵产物分析1067总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数52010022说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF浙江省自然科学基金申请书（2005版）第4页申请书版本号：88000186个人介绍：阮红：女，1968年出生，博士，副教授，硕士生导师。1991年山东大学微生物学专业本科毕业，1994年浙江大学植物病理学生物技术专业硕士研究生毕业后留校任教。2001年浙江大学在职博士研究生毕业。攻读博士学位期间，获德国政府DAAD奖学金“博士生联合培养计划”资助，赴德国Ulm大学进行博士论文研究工作。2002年赴美国加州大学圣地亚哥分校进修。2004年8月调入浙江大学城市学院工作，任生物技术系执行主任。曾主持国家教育部留学回国人员启动基金项目，先后参加国家自然科学基金、国家自然科学青年基金及国家863计划资助项目的研究工作。现在主持城市学院人才基金项目“谷氨酸棒杆菌γ-聚谷氨酸酶复合体pgsBCA基因的克隆”。多年来，曾在国际学术刊物JBiotechnology和中国科学等国内学术刊物上发表论文18篇，其中被SCI收录3篇，12篇为第一作者。学位获得：1987---1991：山东大学微生物学系，微生物学专业学士学位。1991---1994：浙江大学生物技术研究所，植病专业生物技术方向硕士学位。1996---2001：浙江大学生物化工专业生物工程方向博士学位。在职就读浙江大学博士期间，于1999年9月至2000年12月，获德国政府DAAD奖学金“博士生联合培养计划”资助，赴德国Ulm大学微生物与生物技术系从事谷氨酸棒杆菌乙酸代谢调控机制的博士论文研究。主持科研项目：2002,12–2004,12主持国家教育部留学回国人员启动基金项目------谷氨酸棒状杆菌碳分解代谢调控蛋白基因ccpA克隆及其代谢调控机制研究（项目编号：108201-G50229，资助经额为三万元）；2004，8-2006，8主持城市学院人才基金项目------谷氨酸棒杆菌γ-聚谷氨酸酶复合体pgsBCA基因的克隆（资助经额为六万元）主要科研论著：1.RUANHong,GestmeirR,SchnickS,EikmannsB.TheamrG1geneisinvolvedintheactivationofacetateinCorynebacteriumglutamicum.TheScienceinChinaSer.CLifeScience,2005,48(2):97-105（SCI收录，通讯作者）2.阮红,GestmeirR,SchnickS,EikmannsB.amrG1基因在谷氨酸棒杆菌乙酸活化中的作用中国科学C辑,2004,34(3):223-231（SCI收录，通讯作者）3.阮红,宣日荣谷氨酸棒状杆菌在乙酸代谢PTA,AK,ICLandMS酶活测定。enzymesinvolvedinacetatemetabolismofCorynebacteriumglutamicum.浙江大学学报(农业与生命科学版)2003,29(5):529-533.4.GestmeirR,WendischVF,SchnickeS,RuanH,FarwickM,ReinscheidD,EikmannsB.AcetatemetabolismanditsregulationinCorynebacteriumglutamicum.JBiotechnology,2003,104:99-122（SCI收录）5.阮红,EikmannsBernhard转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析。微生物学报2002,42(3):326-3306.阮红,EikmannsBernhard谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建。微生物学报2002,42(4)：80-867.阮红,GestmeirRobert,EikmannsBernhard谷氨酸棒状杆菌在乙酸盐和葡萄糖基质上的蓝白生长筛选.浙江大学学报(农业与生命科学版)2002,28(2):141-1468.阮红,吕志良女贞子多糖免疫调节作用研究。中国中药杂志1999,24（11）：691-6939.许学伟,吴敏,阮红,黄伟达,迪丽拜尔·托乎提一个新的Br蛋白基因部分序列测定及分析.遗传,2004,26(3):343-348。10.许学伟,吴敏,阮红,洪吉,黄伟达嗜盐古生菌AJ4中BR蛋白基因部分片段和16srRNA基因序列研究。中国生物化学与分子生物学报,2004,20(1):55-60ZJNSF浙江省自然科学基金申请书（2005版）第5页申请书版本号：88000186ZJNSF浙江省自然科学基金申请书（2005版）第6页申请书版本号：88000186申请经费预算10.0万元计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1．信息费文献检索,资料复印,版面费0.22．专题学术活动费参加学术会议和科研交流0.43．仪器和设备购置费试剂/药品购置；玻璃器皿和实验室易耗品7.04．能源材料费材料购置,实验室维持0.55．计划管理费按学校规定0.46．人员费课题组成员劳务费1.5注：开支范围和标准参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。ZJNSF浙江省自然科学基金申请书（2005版）第7页申请书版本号：88000186申请者承诺：我保证：（1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。签字：日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章日期.ZJNSF浙江省自然科学基金申请书（2005版）第8页申请书版本号：88000186项目：γ-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控性质：一般项目1、项目研究意义本项目申请与2005年浙江省自然科学基金申请指南第(12)项农业资源产业生物技术研究方向中提及“食品、功能与药用物质发酵生产所需的高效工程菌”重点问题研究基本吻合。γ-聚谷氨酸（Polyγ-glutamicacid，γ-PGA）是由D-谷氨酸或L-谷氨酸的γ-羧基与氨基通过酰胺键连接聚合而成的均氨基酸化合物，分子量在1×105~1×107道尔顿范围内。作为一种生物高分子材料，γ-PGA具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点，可广泛应用于食品包装到一次性餐具使用；γ-PGA又具有极佳的高吸水性和保湿性,可增强人体对维生素及矿物质的吸收,用于医药、化妆品、功能保健食品和饮料产业；γ-PGA还有抗菌抗氧化等污水处理功效[1-4]。虽然目前γ-PGA的市场需求和销售前景十分可观，但浙江省乃至国内的γ-PGA规模化生产尚在酝酿中。近来国内外主要选用以枯草芽孢杆菌为代表的微生物发酵法来生产γ-PGA。早在1937年由Ivanovics[5]首先在Bacillusanthracis的荚膜中发现了γ-PGA，此后微生物发酵法生产γ-PGA有了一些尝试性研究。特别是二十世纪九十年代后，在分离筛选以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis为代表的γ-PGA高产菌株方面做了大量的科学实验。Kubota从土壤中分离得到的一株BacillussubtilisF201，该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量[6]，该菌株已被MeijiSeikaKaisha公司成功用于工业化大规模生产γ-PGA。Ogawa对BacillussubtilisMR141进行培养条件优化，在30L的发酵罐中可使γ-PGA最大产量达到35g/L[7]。Yoon对BacilluslicheniformisATCC9945a采用流加高密度培养的方法，