TaKaRa定量PCR介绍.

January10,2020实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司•主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例实时荧光定量PCR介绍2January10,2020•RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍3January10,2020•RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析病毒及病原菌检测物种鉴定基因分型绝对定量相对定量实时荧光定量PCR介绍4January10,2020•RealTimePCR的原理激发光发射光使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。RealTimePCRCt值实时荧光定量PCR介绍5January10,2020•RealTimePCR的原理同一个样品重复96次PCR的扩增曲线Ct值实时荧光定量PCR介绍6January10,2020•RealTimePCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号值达到设定的阈值时所经历的循环数。(C-代表Cycle，t-代表threshold）Ct值概念阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。RealTimePCR中的概念实时荧光定量PCR介绍7January10,2020•在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。RealTimePCR的原理实时荧光定量PCR介绍8January10,2020•生产厂商仪器名称TaKaRa公司ThermalCyclerDiceTP800AppliedBiosystems公司ABIPRISM7700、7000、7300、7900HT、7500FastRoche公司LightCycler®2.0、LightCycler®480Cepheid公司SmartCycler、SmartCyclerII、SmartCycler®TDBio-Rad公司iCycleriQ、iQ5Real-TimePCRDetectionSystemCorbettResearch公司Rotor-gene2000、Rotor-gene3000、Rotor-gene6000MJResearch公司Opticon、MJMiniCycler、MiniOpticonStratagene公司Mx4000®、Mx3000P®、Mx3005PTM杭州博日LINE-GENEFQD-33A、LINE-GENEFQD-66ARealTimePCR检测系统--简介实时荧光定量PCR介绍January10,2020•LightCycler®480Rotor-gene6000MiniOpticonMx3005PTMLINE-GENEFQD-66AABIPRISM7500iQ5Real-TimePCRDetectionSystemTaKaRaTP800实时荧光定量PCR介绍January10,2020•各公司RealTimePCR检测系统比较仪器名称反应孔数反应孔间独立性检出通道升降温速度TubeROX荧光校正功能TaKaRaDiceTP80096无2-4快0.2ml普通Tube无ABI700096无4快、慢两种0.2ml8联管、专用Cap有ABI7500Fast5快LightCycler2.032无6快专用毛细玻璃管无LightCycler48096or3845快专用板SmartCycler16(6×16)有4快专用、塑料＋石英无Rotor-Gene300036(0.2ml)72(0.1ml)无4慢0.2ml为普通Tube,0.1ml为专用Tube无MiniOpticon48无2快0.2ml普通Tube无iQ5Real-TimePCRDetectionSystem96无5快0.2ml普通Tube无LINE-GENEFQD-66A66无4快0.2ml普通Tube无Mx3000P®96无4慢0.2ml8联管或单管有Mx3005PTM5实时荧光定量PCR介绍January10,2020•RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍12January10,2020•TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI荧光染料嵌合法荧光探针法RealTimePCR的检测方法实时荧光定量PCR介绍13January10,2020•荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI实时荧光定量PCR介绍14January10,2020•Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer热变性FFFF实时荧光定量PCR介绍15January10,2020•TaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5’端标记一个报告基团（Reporter），3’端标记一个淬灭基团（Quencher）。RQ实时荧光定量PCR介绍16January10,2020•RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性退火延伸TaqManProbe法原理示意图实时荧光定量PCR介绍17January10,2020•CycleavePCR法原理Cyclingprobe为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基团（Reporter），一端标记一个荧光淬灭基团（Quencher），寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。RNaseHQRNAR实时荧光定量PCR介绍18January10,2020•热变性PrimerQFPrimerPol.退火QFRNaseHPrimerPol.延伸QFCycleavePCR法原理示意图实时荧光定量PCR介绍19January10,2020•One-StepRT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高Probe法Probe合成费用高SYBRGreenI法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBRGreenI法简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测实时荧光定量PCR介绍20January10,2020•主要内容2RealTimePCR实验方法反转录反应◇OneStep和TwoStepRT-PCR的选择◇RTPrimer的选择◇TotalRNA中GenomicDNA混入的对策◇RealTimePCR引物及探针的设计◇引物反应性确认◇PCR条件优化顺序RealTimePCR反应实时荧光定量PCR介绍21January10,2020•OneStep和TwoStepRT-PCR的选择Two-StepRT-PCRRNART反应PCR反应cDNAOne-StepRT-PCR实时荧光定量PCR介绍22January10,2020•Two-StepRT-PCR高扩增效率cDNA使用更加灵活更多RTPrimer选择常用于mRNA表达量分析等One-StepRT-PCR操作简便有效降低污染特异性RTPrimerOne-StepRT-PCR常用于病毒、病源菌检测等OneStep和TwoStepRT-PCR的选择实时荧光定量PCR介绍23January10,2020•RTPrimer的选择RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer实时荧光定量PCR介绍24January10,2020•目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以内适用，RT效率较高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不适用于复数基因的检出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RTPrimer的选择实时荧光定量PCR介绍25January10,2020•TotalRNA中GenomicDNA混入的对策PCRPrimerexonintronexonGenomicDNAcDNAexonexonPCRPrimerRealTimePCRRealTimeRT-PCRSmallPCRProductSmallPCRProduct此种情况必须采用DNaseI处理，去除基因组DNA。融解曲线分析实时荧光定量PCR介绍26January10,2020•PCRPrimerexonintronexonGenomicDNAcDNAexonexonPCRPrimerRealTimePCRRealTimeRT-PCRLongPCRProductorNoProductSmallPCRProduct融解曲线分析可以区分cDNA或者基因组DNA来源的扩增产物。TotalRNA中GenomicDNA混入的对策实时荧光定量PCR介绍27January10,2020•PCRPrimerexonintronexonGenomicDNAcDNAexonexonPCRPrimerRealTimePCRRealTimeRT-PCRNoProductSmallPCRProduct融解曲线分析TotalRNA中GenomicDNA混入的对策实时荧光定量PCR介绍28January10,2020•RealTimePCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物实时荧光定量PCR介绍29January10,2020•两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在300bp以内)★扩增片段大小★17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性★★★特异性△引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列△引物3’末端避免2base以上的互补序列★★★互补性3’末端序列△整体上碱基不能过偏△个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)△避免T/C连续，A/G连续★序列★△3’末端避免GCrich或ATrich△3’末端碱基最好为G或C△3’末端碱基尽量避免为T尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物设计原则实时荧光定量PCR介绍30January10,2020•RefSeq序列目的基因序列获得引物设计分析序列特异性确认基因组序列确认目的基因RealTimeRT-PCR引物好的引物需要寻找好的参照序列RealTimePCR引物设计通过NCBI获得参考序列和相关情报。RefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。序列可信度高，信息量大实时荧光定量PCR介绍31January10,2020•LOCUSNM_0087771959bpmRNAlinearROD15-APR-200