Tan第六章外源基因的表达.

1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide1本课程内容•第一章绪论•第二章基因克隆的工具酶•第三章基因工程的载体•第四章目的基因的制备•第五章目的基因导入和重组子的筛选•第六章外源基因的表达•第七章基因操作的基本技术•第八章植物基因工程及应用•第九章动物基因工程及应用•第十章医学基因工程及应用1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide2第六章外源基因的表达第一节大肠杆菌表达系统第二节E.coli重组蛋白的限制因素第三节真核生物表达系统1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide3引言•生物技术的应用可以追溯到4000年前，新石器时代的晚期，利用发酵过程生产蜂蜜酒。20世纪，随着一系列的微生物在工业上的应用，生物技术得到了广泛的发展。1927年，AlexanderFleming发现Penicillium能够合成青霉素。随后，真菌和细菌被广泛应用于大规模的生产抗生素。许多重要的医药，并不是来自于微生物，而是高等生物产生的。基因工程的应用，带来了生物技术的革命。基因工程意味着重要的植物或动物蛋白基因可以从宿主中分离出来，插入载体，引进细菌获得大量蛋白。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide4外源基因表达体系：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。•有基因表达载体和受体细胞两部分组成。•原核基因表达系统和真核基因表达系统。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide5•原核生物作为基因表达系统的受体细胞的特点：•单细胞异养，生长快，代谢易控制。•基因组结构简单，基因操作和分析容易。•含有质粒或噬菌体，易于构建表达载体。•生理代谢途径及基因表达控制机制比较清楚。•无真核生物的蛋白质加工系统。•有内源蛋白酶1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide6原核细胞：起始密码子首选AUG;SD序列；SD序列与起始密码子的距离（3～9bp）；翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。•真核细胞：起始序列的共同序列-CCA(G)CCAUGG-•密码子的使用频率•终止密码子：UAA1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide7mRNA的延伸与稳定性•防止非特异性终止：避免衰减子；加入抗终止的序列元件。•转录终止序列：保证转录正常终止，防止产生不必要的转录终止产物，使mRNA的长度限制在一定范围内，增加外源基因表达的稳定性。•Poly(A)掺入信号序列1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide8表达蛋白在细胞中的稳定性：•防止表达产物被内源蛋白水解酶水解途径：a.构建融合蛋白表达体系b.构建分泌蛋白表达体系c.构建包涵体表达体系d.选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide9目的基因的沉默•位置效应的基因沉默•转录水平的基因沉默•转录后水平的基因沉默1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide10第一节大肠杆菌表达系统•大肠杆菌基因表达载体的重要组成元件：•启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7•核糖体结合位点•插入位点•终止子•复制起始区•选择标记1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide11•外源基因在大肠杆菌中的表达形式：•包涵体、融合蛋白和分泌蛋白•寡聚型外源蛋白：a.多表达单元的串联重组b.多顺反子重组c.多密码序列重组•整合型外源蛋白：将外源基因整合到宿主染色体非必需编码区，在合适的条件下高效表达。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide12融合蛋白、分泌蛋白和包涵体•融合蛋白(fusionprotein)：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称为融合蛋白。•分泌型蛋白(secretedprotein)：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。•包涵体(inclusionbody)：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide13一、基因表达信号如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组信号，这些信号必须能被细菌识别。这些信号都是一些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号，三个最重要的信号：1）promoter:是转录起始信号，在E.coli中，启动子必须能被RNA聚合酶的sigma亚基所识别。2）Teminator：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide143）核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。高等生物的基因也被表达信号所包围，但他们的核苷酸序列与E.coli的并不相同。比较E.coli和人类的启动子，有一些是相同的，但是E.coli的RNA聚合酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类基因的表达信号。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide15基因表达的信号1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide16•解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E.coli表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide17表达载体的结构1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide18•（一）启动子启动子是表达载体的最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。获得重组蛋白的数量很大程度上取决于表达载体所携带的启动子。•启动子：诱导型启动子组成型启动子•调控元件1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide19真核与原核生物启动子的差异1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide20•a)启动子的选择所有E.coli启动子都有两个保守序列，保守序列的变化是影响转录效率的主要因素。强启动子可以启动高效率的表达，合成大量表达产物。相反，弱启动子，在细胞中表达量较低。表达载体应该含有强启动子，这样克隆的基因可以以最高的速度表达。建立表达载体的另一个需要考虑的因素是启动子的调控，主要有两种调控方式：诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基因的表达才能启动抑制：可抑制的基因是在加入调控物后表达被关闭。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide21大肠杆菌基因表达的调控方式1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide22•基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅是间接的。许多参与诱导和抑制的序列存在于启动子的周围。所以诱导和抑制启动子的化学试剂也同样调控克隆基因的表达。如果重组蛋白对细菌有害，其合成必须严格控制在毒性的水平之下。可以利用调控物抑制基因的表达。即使重组蛋白对寄主细胞无害，仍然需要调控克隆基因的表达，因为持续的高水平表达可以影响重组质粒的复制，最终导致表达产物的下降。b)表达载体应用的启动子几种使用频率最高的启动子：1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide23•1)lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。2)trp启动子：色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-β-吲哚丙烯酸诱导。3)tac启动子：是lac和trp启动子的杂交分子，比两者都要强，同样可以被IPTG所诱导。4)λPL启动子：是负责λDNA分子转录的启动子之一。λPL启动子是可以被E.coliRNA聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以被λcI基因产物所抑制。携带λPL启动子的载体使用温度敏感的E.colicI突变体。在较低的温度下，1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide24•突变体所产生的cI蛋白可以抑制λPL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。•（二）Cassettes和基因融合一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E.coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个cassette。某些casstte载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结合位点临近，而是在一段E.coli基因之后，E.coli的基因直接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框架的方式进行，这样就产生了杂交的基因。因此基因的表达产物是一个蛋白质的杂交1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide25•分子，包含E.coli阅读框架编码的短肽和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有四种优点：1)克隆基因的mRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如果相关的序列是由E.coli序列组成，可以避免这一可能性。2)在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞降解。3)细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。如ompA或者malE基因，这样重组蛋白可以1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide26•被输出到细胞外，进入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。4)细菌片段可以通过亲合色谱法辅助重组蛋白的提取。例如与E.coli谷胱甘肽-S-转移酶融合的蛋白可以吸附到含有结合谷胱甘肽的琼脂糖柱上。E.coli片段的存在可能改变重组蛋白的特性，因此需要切去细菌的片段。通常是通过化学试剂或者酶在结合点或其附近切开。结合点是蛋氨酸，可以通过溴化氰切开（溴化氰能特异的在蛋氨酸处切开）另外，凝血酶等酶可以在精氨酸处切开，FactorXa可以在Gly-Arg后切开多肽。另外还要注意，所用的试剂不会在重组分子内部切开分子。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide27利用CNBr将融合蛋白从蛋氨酸处切下1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide28第二节E.coli重组蛋白的限制因素•在E.coli中生产蛋白仍然存在许多问题，这些问题可以分为两大类：一是因为外源基因的序列；二是因为在E.coli合成重组蛋白存在限制。一、外源基因序列导致的问题有三种方式可能导致核苷酸序列阻止外源基因在E.coli中的高效表达：1）外源基因可能含有内元。E.coli缺乏切除内元的机制。2）外源基因可能含有在E.coli作为终止子的序列。3）基因的密码子可能不适合于E.coli中翻译。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide29•总体上讲，所有的生物都共用相同的密码子，但每一种生物都有偏爱的密码子，表现在tRNA识别不同密码子的效率不同。上述问题都是可以解决的。如果克隆的基因含有内元，可以使用mRNA。定点突变的方法改变可能的终止序列。用E.coli偏爱的密码子。另外一个方法，对于小于2kb的基因可以利用化学合成的片段来代替，利用氨基酸序列作为参考，使用E.coli偏爱的密码子，并保证不会有提前存在的终止序列。1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide30偏爱密码子的问题1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide31核糖体结合位点被遮蔽•1/10/20201:59PM欢迎同学们听课！Slide32•二、E.coli合成重组蛋白的限制利用E.coli作为寄主细胞合成重组蛋白可能遇到的问题与细菌的遗传特性有关，例如：1）E.coli不能加工成正确的重组蛋白。细菌和高等生物的加工过程是不同的。特别是一些动物的蛋白要进行糖基化。糖基化在E.coli中是非常罕见的，在E.coli中合成的蛋白不能正确的糖基化。2）E.coli