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15、试剂的配制5.110%FBS-RPMI-1640培基100ml：RPMI-1640培养液87ml胎牛血清10ml100×谷氨酰胺1mll0000U/ml青、链霉素双抗2ml经0.22μm过滤器过滤除菌后4℃保存备用5.20.4%台盼蓝染液：0.4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，再加双蒸水至10ml，滤纸过滤，4℃保存。取上述4%染液1ml，加PBS9ml，稀释为0.4%染液。5.3磁珠分离缓冲液100ml：PBS(PH7.2-7.4)100ml牛血清白蛋白0.5gEDTA58.45mg经0.45μm过滤器过滤除菌后4℃保存备用5.40.5%BSA-PBS液100ml：PBS100mlBSA0.5g经0.45μm过滤器过滤除菌后4℃保存备用5.5Monensin稀释液20ml：Monensin原液2.0ml完全性RPMI-1640培养基18.0ml22、留取脾脏、脾单个核细胞计数1)10%水合氯醛按3ml/kg腹腔注射麻醉小鼠后，小鼠取右侧位，消毒左侧背腹部皮肤，取无菌眼科剪剪开腹部外皮肤，再以无菌止血甜分离皮肤和肌肉。以无菌眼科镊轻轻提起小鼠脾脏，剪掉其周围筋膜和脂肪组织，小心分离出脾脏，用无菌SAL洗去脾脏血迹，将脾脏装入以预装有3mlRPMI-1640培养液的5ml无菌离心管中，轻轻摇晃，洗去新鲜脾脏表面残留的血迹和组织残渣以备研磨。2)超净台消毒、灭菌等准备工作完毕后，于50ml无菌离心管中倒入5mlRPMI-1640培养液，将一次性无菌200目细胞筛网置于离心管口上、用培养液湿润，用无菌眼科镊固定脾脏、无菌眼科剪尽量剪碎脾脏，再用5ml无菌玻璃注射器活塞轻轻在筛网上研磨小鼠脾脏，最后用2mlRPMI-1640培养液洗涤筛网，以使分散的单个核细胞都进入培养液中。3)400g离心10分钟。4)弃去上清，往细胞沉淀中加入5倍细胞体积的无菌红细胞裂解液，轻轻吹打混匀后裂解2分钟。5)400g离心5分钟。6)无菌PBS10ml洗涤。7)400g离心5分钟。8)弃去上清后加入5mlRPMI-1640培养液重悬细胞，充分打散细胞团，取10μl细胞悬液加于血细胞计数板上，计算小鼠脾单个核细胞总数。9)10）同时进行细胞活性测定：利用台盼蓝拒染法检测，原理即死细胞可被台盼蓝染成天蓝色，而活细胞不着色、透明圆润、有折光性。将细胞悬液与0.4%台盼蓝染液1：1混合后在显微镜下进行计数，5分钟内总共计数200个细胞。存活率=活细胞数/总细胞数×100%3、脾CD4+T细胞的分离、计数1)确定细胞总数后，将收集的小鼠脾单个核细胞悬液加入冰PBS2ml洗涤一次，34℃，300g离心l0分钟，弃去上清。（以下2-7冰上操作）2)每107个细胞加90μl缓冲液重悬。3）每107个细胞加l0μlCD4MicroBeads。4)混匀，4℃孵育15分钟。5）每107个细胞加1ml缓冲液洗涤，4℃，300g离心l0分钟，弃去上清。6)每108个细胞500μl缓冲液重悬？。7)准备好磁珠分选器及操作台。将LS分离柱置于MidiMACS分选器中,下面放置无菌15ml离心管接收过柱液。8)移液管吸取3ml缓冲液进行润柱(加入缓冲液时均应注意动作轻缓，不要产生气泡影响细胞回收率)。9）待润柱缓冲液即将流空时，将上述备过柱的已孵育免疫磁珠的单个核细胞悬液分次缓慢加入分选柱中进行过柱；10）当标本快过完柱时，再吸取3ml缓冲液冲洗LS分选柱共3次。11）取下柱子，下接新的15ml无菌离心管，在柱子中加入5ml缓冲液后快速用活塞推出，离心管中收集的细胞即为免疫磁珠阳性分选的CD4+T细胞悬液。12)在20℃，300g(+2,-2)条件下离心lO分钟去除缓冲液,得到CD4+T细胞团。13)用RPMI-1640培养基2ml洗涤1次,离心5分钟、弃上清。加入2ml10%RPMI-1640培养基重悬细胞，并取10μl在血细胞计数板上计算CD4+T细胞数，并进行细胞活力检测。14)细胞活性检测:将细胞悬液与0.4%台盼蓝染液1:1混合,血细胞计数板上计数200个细胞,5分钟内计数,存活率=活细胞数/总细胞数×100%。4、Th2-Th17双表型细胞定向分化培养1)将小鼠分离纯化的小鼠脾源性CD4+T细胞，按1×l06个/1ml加入12孔板中，进行体外定向分化培养观察。2)参考SalojinKV等的方法[1]，在培养基中加入以下细胞因子，组成定向分化微环境，诱导Th2细胞的分化成熟，即IL-225U/ml4IL-420ng/mlanti-IL-1210μg/mlanti-IFN-γ10μg/mlanti-CD32μg/mlanti-CD282μg/ml其中各组中的a-TCR刺激剂(anti-CD3+anti-CD28)和分化所需细胞因子均先加入培养基中，细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养。3)6天后，收集各组一部分细胞，离心后按1×l06个/1ml加入12孔板中。参考WangYH等的方法[2]，在培养基中加入以下细胞因子，组成定向分化微环境，诱导Th2-Thl7细胞的分化成熟，即IL-1β20ng/mlIL-620ng/mlIL-2310ng/mlanti-IFN-γ20μg/ml细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养。3天后，收集各组细胞及其培养上清液。同时，各组另一部分细胞按第5部分流式细胞检测方法，通过检测细胞内IL-4表达，反应各组Th2细胞分化情况。5、流式细胞仪检测终止收集细胞前5小时，取10μl进行计数，再遵联科生物公司流式检测指南，按以下浓度加入PMA50ng/mlLonomycin1μg/mlMonensin3μg/ml刺激培养5h。1)收集：设置空白对照管。每个5ml流式管收集约1×106个细胞，室温、350g条件下离心5分钟，移出上清冻于-80℃，避免丢失细胞。52)洗涤：含0.5%BSA-PBS3ml洗涤细胞1次以终止反应(室温、350g、离心5min)，弃上清。3)每管100μlPBS重悬，加入100μl固定剂，室温、避光孵育15分钟。4)含0.5%BSA-PBS3ml洗涤细胞1次，室温、350g条件下，离心5分钟，弃上清。5)加100μl破膜剂重悬细胞，分别依次加入推荐剂量的PE-抗IL-4(1.25μl)、APC-抗IL-17A(1.25μl)的抗体，混匀1-2秒，室温、避光孵育20分钟。6)含0.5%BSA-PBS3ml洗涤细胞1次，室温、350g条件，离心5分钟，弃上清。7)离心，弃上清，用0.3ml0.1%多聚甲醛重悬（空白管用0.5ml），避光、4℃保存，待行流式检测。四、流程2、留取脾脏、脾单个核细胞并计数准备材料、试剂数量备注：5ml无菌离心管3支预装3ml培养液/支10%水合氯醛1瓶无菌治疗巾1张胶布1卷无菌纱布1包10ml注射器1支(抽满无菌SAL)生理盐水100ml500ml塑料杯1个75%酒精500ml95%酒精灯1个加好酒精打火机1个外用1个提前放入超净台手术器械动物用1套细胞用1套提前放入超净台50ml无菌离心管3支（预装5ml培养液/支）提前放入超净台6RPMI-1640培养液50ml提前放入超净台3ml移液管4个/份标本提前放入超净台50ml、15ml试管架各1个提前放入超净台200目细胞筛网3个提前放入超净台无菌红细胞裂解液Beyotime的提前放入超净台无菌PBS50ml提前放入超净台血细胞计数板2块提前放入超净台盖玻片1盒提前放入超净台0.4%台盼蓝染液1瓶提前放入0.5mlEP管2个/份标本预装台盼蓝10μl,超净台1)10%水合氯醛按0.06ml/只腹腔注射麻醉3只小鼠后，取右侧位，消毒左侧背腹部皮肤，无菌分离出脾脏，无菌SAL洗去脾脏血迹，将脾脏装入以预装有3mlRPMI-1640培养液的5ml无菌离心管中。2)超净台消毒、灭菌等准备工作完毕后，于50ml无菌离心管中倒入5mlRPMI-1640培养液，将一次性无菌200目细胞筛网置于离心管口上、用培养液湿润，用无菌眼科镊固定脾脏、无菌眼科剪尽量剪碎脾脏，再用5ml无菌玻璃注射器活塞轻轻在筛网上研磨小鼠脾脏，最后用2mlRPMI-1640培养液洗涤筛网，以使分散的单个核细胞都进入培养液中。3)400g离心10分钟。4)弃去上清，往细胞沉淀中加入5倍细胞体积的无菌红细胞裂解液，轻轻吹打混匀后裂解2分钟。5)400g离心5分钟。6)无菌PBS10ml洗涤。7)400g离心5分钟。8)弃去上清后加入5mlRPMI-1640培养液重悬细胞，充分打散细胞团，取10μl细胞悬液加于血细胞计数板上，计算小鼠脾单个核细胞总数。9)710）细胞活性测定：细胞悬液10μl与0.4%台盼蓝染液10μl混合后在显微镜下进行计数，5分钟内总共计数200个细胞。存活率=活细胞数/总细胞数×100%3、脾CD4+T细胞的分离、计数准备材料、试剂数量备注：15ml无菌离心管6支提前放入超净台RPMI-1640培养液50ml提前放入超净台10%FBS-1640培养液50ml提前放入超净台MidiMACS磁珠分选器1个提前放入超净台磁珠操作台1个提前放入超净台LS分离柱3个提前放入超净台Anti-BiotinMicroBeads1瓶预冰，提前放入超净台Biotin-AntibodyCocktail1瓶预冰，提前放入超净台磁珠分离缓冲液50ml预冰，提前放入超净台无菌PBS50ml预冰，提前放入超净台冰盒1个提前放入超净台可复性冰袋3个提前放入超净台(重复)3ml移液管4个/份标本提前放入超净台(重复)0.5mlEP管2个/份标本预装台盼蓝10μl,超净台(重复)打火机1个提前放入超净台(重复)50ml、15ml试管架各1个提前放入超净台(重复)血细胞计数板2块提前放入超净台(重复)盖玻片1盒提前放入超净台(重复)0.4%台盼蓝染液1瓶提前放入超净台1)确定细胞总数后，将收集的小鼠脾单个核细胞悬液加入冰PBS2ml洗涤一次，4℃，300g离心l0分钟，弃去上清。（以下2-7冰上操作）2)每107个细胞加90μl缓冲液重悬。3）每107个细胞加l0μlCD4MicroBeads。84)混匀，4℃孵育15分钟。5）每107个细胞加1ml缓冲液洗涤，4℃，300g离心l0分钟，弃去上清。6)每108个细胞500μl缓冲液重悬？。7)准备好磁珠分选器及操作台。将LS分离柱置于MidiMACS分选器中,下面放置无菌15ml离心管接收过柱液。8)移液管吸取3ml缓冲液进行润柱(加入缓冲液时均应注意动作轻缓，不要产生气泡影响细胞回收率)。9）待润柱缓冲液即将流空时，将上述备过柱的已孵育免疫磁珠的单个核细胞悬液分次缓慢加入分选柱中进行过柱；10）当标本快过完柱时，再吸取3ml缓冲液冲洗LS分选柱共3次。11）取下柱子，下接新的15ml无菌离心管，在柱子中加入5ml缓冲液后快速用活塞推出，离心管中收集的细胞即为免疫磁珠阳性分选的CD4+T细胞悬液。12)在20℃，300g(+2,-2)条件下离心lO分钟去除缓冲液,得到CD4+T细胞团。13)用RPMI-1640培养基2ml洗涤1次,300g、离心5分钟、弃上清。加入2ml完全性RPMI-1640培养基重悬细胞，并取10μl在血细胞计数板上计算CD4+T细胞数，并进行细胞活力检测。14)细胞活性检测:将10μl细胞悬液与0.4%台盼蓝染液10μl混合,血细胞计数板上计数200个细胞,5分钟内计数,存活率=活细胞数/总细胞数×100%。4、Th2-Th17双表型细胞定向分化培养1)取12孔培养板，参考SalojinKV等的方法[1]，在培养基中加入以下细胞因子，组成定向分化微环境，诱导Th2细胞的分化成熟，分别作如下标记及加入试剂：其中各组中的a-TCR刺激剂(anti-CD3+anti-CD28)和分化所需细胞因子均先加入培养基中，细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养。均以1×106个/ml为标准文献要求浓度原液浓度(ng/μl)应加原液量进行稀释稀释液加入量(μl)取原液量完全性培养稀释液浓度稀释液9(ng/ml)(μl)(μl)基量(μl)(