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可溶性肝素结合性表皮生长因子促进表皮生长因子受体转运到细胞核NataliiaV.Korotkevych*,AndriiJu.Labyntsev,DenisV.Kolybo,SerhiyV.Komisarenko分子免疫学系，乌克兰国家科学院生物化学，乌克兰基辅palladin研究所摘要大多数的表皮生长因子受体（表皮生长因子受体）的配体有能力诱导表皮生长因子受体易位到细胞核中，在细胞核中表皮生长因子受体作为一个重要的转录调控因子。可溶性肝素结合表皮生长因子（sHB-EGF）在许多类型的细胞是表皮生长因子受体（EGFR）的一种配体；然而，目前没有证据表明sHB-EGF有诱导EGFR核输入的能力。在此，我们证明了在这里，用sHB-EGF处理A431细胞导致EGFR核定位且是通过逆行途径发生这种定位。由共聚焦显微镜和免疫共沉淀分析表明，易位复合体包括配体和受体两种。染色质免疫沉淀实验表明在细胞核中细胞周期蛋白D1启动子区域与SHB-EG-EGFR复合物的关联，通过EGFR激酶抑制剂AG-1478的应用阻止止这种关联。根据所获得的数据表明，SHB-EGF同样对其它EGFR配体起作用，并能够诱导EGFR的核易位作为配体-受体复合物中酪氨酸磷酸化依赖性的一部分。引言肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）是EGF生长因子家族中的一员。它具有高亲和力的肝素和硫酸乙酰肝素[1]。HB-EGF的前体合成的I型跨膜蛋白（ProHBEGF），它的分裂是通过胞外蛋白酶，导致sHB-EGF脱落。sHB-EGF介导旁分泌和促进生存、增殖和不同细胞类型迁移的表皮生长因子受体家族的受体ErbB1（EGFR）和ErbB4自分泌活化[2]。这些自分泌和旁分泌的sHB-EGF活动可以作为肿瘤促进因子。目前很清楚的知道可溶性HB-EGF和proHB-EGF作用方式是不相同的，HB-EGF一些生物活性是以可溶性形式被限制（如诱导EGFR自分泌活化的能力）。配体结合到表皮生长因子受体导致表皮生长因子受体的激活，内化和进一步的循环，或者导致配体-受体复合物的溶酶体降解[3]。一些表皮生长因子受体成员如ErbB1[4]，ErbB2[5]和ErbB3[6]已以完整的形式在细胞核中检测出。这些受体的核定位也在不同的正常[7，9]或恶性细胞[10]中发现。所有ErbB蛋白含有核定位信号（NLS），核受体通过核孔复合体[11]运输需要这种信号。在细胞核中，这些蛋白可能通过直接与转录调控因子[12]结合来调节特定靶基因的转录。例如，核表皮生长因子受体作为一种转录因子，导致激活的基因需要高的增殖活动。当表皮生长因子被刺激后，EGFR转位到细胞核内与cyclinD1启动子近端结合后刺激其表达，引起细胞增殖[10]。有趣的是，EGFR本身缺乏DNA结合域，这就是为什么它会与其他的DNA因子如STAT3STAT5结合需要EGFR的能力去激活特定基因[13,14]。据研究报道表明HB-EGF前体被局限在人膀胱移行细胞癌的肿瘤细胞核中[15]。核proHB-EGF可在活性氧（ROS）[16]的作用下从细胞核输出。然而，目前暂时没有证据表明sHB-EGF的核定位，以及sHB-EGF诱导表皮生长因子受体核易位能力。在本研究中我们解决了这些问题并揭示了sHB-EGF/EGFR复杂的核周区转运。材料和方法细胞培养A431细胞[17]是从乌克兰国家科学院放射实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所得到的，在RPMI-1640L-谷氨酰胺培养基上进行细胞培养，添加10%的胎牛血清（FBS）和青霉素链霉素两性霉素B（σ-奥德里奇，密苏里，美国）。显微镜实验时，把细胞放在35毫米的盘子里盖上盖玻片接种过夜。质粒结构人的sHB-EGF和之前所描述的mCherrysHB-EGF重组质粒的构建。简单来说，这两种结构是基于pET28a质粒和大肠杆菌表达菌株BL21DE3Rosetta。编码来自U937细胞的HB-EGF的全长形式的DNA用于编码sHB-EGF的可溶性的扩增片段。扩增基因片段与用BamHI和XhoI酶切位点的表达载体pET28a合并。因此，基因工程的pET28a-SHB-EGF已获得。为了获得的pET-28amCherry-SHB-EGF，mCherry编码序列从质粒pmCherry（CLONETECH，USA）中扩增，在sHB-EGF的5’-端使用XhoI和PstI酶切位点酶切位点插入pET28asHB-EGF，所有分子克隆试剂购自ThermoScientific（MA，USA）购得。pEGFREYFP质粒由V.Verkhusha（艾伯特爱因斯坦学院，美国纽约）教授亲情提供，P23EYFP质粒由J.Rędowicz教授（Nencki生物化学研究所，波兰华沙）亲情提供。pEGFR-EYFP和p23-EYFP质粒对A431细胞的转染用的是LipofectAMINELTX（英杰公司，加利福尼亚州，美国）进行。重组蛋白的生产用于重组sHB-EGF和mCherrysHB-EGF生产，在标准化培养协议条件下我们用大肠杆菌表达菌株BL21DE3Rosetta。过夜培养物稀释1:20与含有2％葡萄糖（Sigma-Aldrich公司，密苏里州，美国）LB培养基中培养，达到37°C，OD600=0.5–0,7的细胞密度。经IPTG诱导后，细胞在最佳温度培养3–3.5小时即可。细菌重组蛋白的纯化根据制造商的建议通过科学和生产企业的“烯胺”（乌克兰基辅）以Ni-NTI琼脂糖层析（Qiagen公司，林堡，荷兰）进行。在变性条件下用烯酰胺凝胶电泳验证重组蛋白的纯度。sHB-EGF和mCherry-sHB-EGF的增殖活动先前的研究已经表明重组蛋白sHB-EGF和mCherrysHB-EGF活性[18,19]，总之，对人类的sHB-EGF和mCherrysHB-EGF的增殖活动用MTT法与小鼠成纤维细胞BALB/c3T3（乌克兰实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所国家科学院）进行评价。重组蛋白能够促进3T3细胞增长和细胞迁移，与未经处理的细胞相比，高达30至35%。用EGFR激酶活性抑制剂AG1478（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）和基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂GM6001（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）证明SHBEGF作用特异性。GM6001是用来抑制通过体外培养的细胞自分泌sHB-EGF生产。结果表明，mCherrysHB-EGF能够在3T3细胞和A431细胞中分别诱导ERK1/2（#4370，细胞信号技术，美国）和p38丝裂原活化蛋白激酶（sc-7149、圣克鲁斯生物、美国）磷酸化。通过共聚焦显微镜用抗表皮生长因子受体（e2760，西格玛奥德里奇，密苏里，美国）和二次FITC标记的抗体（f5387，西格玛奥德里奇，密苏里，美国）证实了mCherrysHB-EGF在A431细胞表面特异性结合的受体的能力。细胞组分的分离和免疫印迹分析在这项研究中使用的抗体为抗核纤层蛋白B1（#33–2000，Invitrogen公司，美国），抗EGFR单克隆抗体（e2760，西格玛奥德里奇，密苏里，美国），抗肌动蛋白单克隆抗体（8226，图，美国）、抗GST（a7340，西格玛奥德里奇，密苏里，美国），ERK1/2（sc-135900，圣克鲁斯生物技术，美国），totalp38（sc-7149、圣克鲁斯生物、美国）二过氧化物酶共轭抗体抗兔IgG（a0545）和抗小鼠IgG（a9044）都是从Sigma奥德里奇公司获得（密苏里，美国）。A431细胞血清饥饿24小时并在不同的时间用SHBEGF（500纳克mL-1）刺激它。在使用AG1478时，在加入sHB-EGF5分钟前用该试剂进行预处理。通过细胞膜裂解缓冲液（10mMHEPES，1,5毫米氯化镁，10毫米氯化钾，0.5mdtt，0.05%NP40（所有从西格玛奥德里奇，密苏里，美国）刺激并破坏细胞。，pH值7.9，HaltProteaseInhibitorCocktail(ThermoScientific，美国)，并在冰上敷10分钟。细胞通过一个25号针头20次并离心1500g5分钟以使细胞核沉淀。上清液再以13000g的最大速度离心20分钟，直至上清液没有细胞核。用细胞膜裂解缓冲液将细胞核清洗3次，以除掉来自细胞质膜的任何杂质。排除非核EGFR核提取物污染的可能性,非刺激和刺激SHBEGF的A431细胞与非刺激和SHBEGF刺激A431细胞非核部分分别混合。然后，细胞核再以最大速度离心并用细胞膜裂解缓冲液再洗三次。把分离的细胞核悬浮在细胞核裂解缓冲液中（5mMHEPES，1,5毫米氯化镁，0,2mmEDTA，0,5毫米DTT，26%甘油，300mMNaCl）然后用简单的超声帮助核溶解并提取核蛋白。核裂解液以13000g速度离心20分钟后进行收集。蛋白质浓度用Bradford法[20]测定。然后样品与Laemmli样品缓冲液[21]混合以950℃的温度加热15分钟。样品进行8%聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE随后转移到硝酸纤维素膜，膜用单克隆或多克隆抗体检测随后用辣根过氧化物酶标记抗体。免疫反应蛋白条带用增强化学发光试剂（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）进行检测。间接免疫荧光法和共聚焦显微镜技术细胞低密度接种于盖玻片上在不同的阶段1%BSA/PBS在溶液中用sHB-EGF（1.5μg/ml）或mCherrysHB-EGF（5μg/ml）处理，用4%多聚甲醛溶液固定（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）。通过MTT法测定重组sHB-EGF最佳浓度。共聚焦显微镜染色的mCherrysHB-EGF最佳浓度通过对A431细胞的流式细胞仪分析来确定。在AG1478抑制剂的应用情况下，在sHB-EGF或mCherrysHB-EGF加入前将细胞预处理5min。细胞核染色用Hoechst33342（奥德里奇，密苏里，美国）。有细胞的玻璃板安装到DABCO/PVA固定液（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）中，用LSM510META激光共聚焦扫描显微镜（CarlZeiss，蔡司，德国）进行分析。图像分析是用斐济软件[22]完成的。图像相当于是整体面板标准化的工具。接下来，把比例尺和Z-Stack协议栈的深度添加到图像。如果需要的话把ROI（感兴趣区域）剪短，把他们的位置进行标记。其次，渠道分为单独的图像和定位分析用RG2B插件计算。染色质免疫沉淀法（芯片）兔血清从完整的苏联金吉拉兔子中获得，严格按照国立卫生研究院实验动物的护理和使用指南建议。该协议是由委员会按乌克兰国家科学院帕拉金生化研究所动物实验的行为准则（协议#925.10.2011）批准的。A431细胞接种于五个10厘米的碟子上，血清饥饿24h和用SHBEGF（500纳克毫升-1）刺，GSTsHB-EGF（1000纳克毫升-1）或0.01%过氧化氢刺激1小时。在AG1478或PAO（氧化苯胂）（西格玛奥德里奇，密苏里，美国）的应用中在加入sHB-EGF或GSTsHB-EGF之前细胞在抑制剂中预处理5分钟，在获得前细胞用1%甲醛40℃处理10分钟DNA的交联蛋白，细胞刮片，冷PBS洗涤，悬浮在500μL的低渗缓冲液中（10mMTris-HCl，pH值7.4，10毫米氯化钾，1mMDTT），通过一个25号针头20次。核沉淀，悬浮在200μSDS裂解缓冲液（含1%SDS、EDTA10毫米、50毫米Tris-HCl，pH8和蛋白酶抑制剂），然后超声两次，每次30s，在冰上冷却急速分离。离心后，用免疫沉淀缓冲液（50mMTris-HCl，pH值8.01505毫米的NaCl，mmedta，np400.5%）按1:10稀释上清液。得到的重组金黄色葡萄球菌的蛋白质正如前面所描述的[23]。蛋白质的SepharoseCL-6B共轭协议（奥德里奇，密苏里，美国）从文章[24]修改。细胞裂解液再次清除是通过完整的兔多克隆血清在40℃培养1h，并用蛋白A进一步培养1h。清除抗原与抗EGFR单克隆培抗体、抗GST抗体培养，或完整的兔多克隆血清过夜。免疫沉淀复合物的收集是通过添加蛋白A琼