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科研项目申请书课题名称：TKTL1和DNASE1L1蛋白在肿瘤早期诊断中的应用协作单位：北京金沐医疗科技有限公司研究期限：2017年-2019年研究类别：预防医学填表日期：2016年8月17日一、摘要研究项目名称TKTL1和DNASE1L1蛋白在肿瘤早期诊断中的应用类别基础研究学科分类医学申报学科领域肿瘤学依托实验室中国医学科学院肿瘤研究所主持人姓名张春光性别男民族汉出生年月职称学位硕士其它所在单位北京金沐医疗科技有限公司项目组成员总人数高级中级初级博士硕士生其他参加单位数姓名年龄职称所在单位项目中的分工申请经费起止年月研摘要：不超过300字（概括研究的对象、研究方法，关健问题、标志性成果等）究内容和意义肿瘤是导致人类的第二大死因，严重威胁人类的健康。目前针对肿瘤的治疗方案还不完善。临床研究表明，早期发现与早期治疗是根治肿瘤的唯一途径。现阶段市场上用于肿瘤早期筛查的标志物都存在明显的缺陷，从而不能做到对肿瘤疾病的早期筛查，诊断与治疗。TKTL1和DNASE1L1是新发现的与肿瘤生长相关的特异性蛋白。TKTL1作为转酮酶在肿瘤细胞粗放的代谢过程中起着至关重要的作用，而这种大量消耗葡萄糖的无氧酵解代谢方式也是肿瘤细胞区别正常细胞的一个标志。DNASE1L1在细胞凋亡过程中降解DNA起关键的作用。这两个蛋白在肿瘤细胞中特异性高表达，且在巨噬细胞中可以被富集和检测。通过检测巨噬细胞中被吞噬的肿瘤相关蛋白TKTL1和DNASE1L1的表达水平可以对早期肿瘤进行筛查与检测。主题词1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文英文二、立项依据与研究内容（1）项目的立项依据单核/巨噬细胞是人类免疫系统细胞的重要组成部分。人类外周血细胞可以主要分为无核细胞（主要为血红细胞）和有核细胞（白细胞等）。单核细胞约占有核细胞总数的5%左右，由髓系造血祖细胞分化而来，是免疫系统中抗原递呈细胞（APC细胞）的重要组分。其在人体循环系统内成熟分化并实现免疫学功能可以大致分为以下步骤：毛细血管中的单核细胞→透过血管壁进入血管外组织→发现异源性物质（细菌、病原体、肿瘤细胞等），分化为成熟的巨噬细胞→吞噬并消化，将抗原递呈到特定的细胞表面分子上→经由淋巴管回流到外周血→完成抗原递呈激活杀伤性免疫细胞。作为机体抗击外来病原侵袭和清楚自身非正常细胞机制的哨兵，巨噬细胞是免疫系统形成免疫应答的重要环节，作用重大。在正常人体内每时每刻都有向着肿瘤化（永生化、非正常凋亡）发展的细胞产生，正常的机体免疫机制可以通过上述过程，将其及时清除。但随着肿瘤细胞的演化，生成了躲避免疫杀伤的机制，或者机体总体免疫力的下降，形成免疫逃逸，最终在患者体内形成肿瘤包块。由此可见无论健康人群还是癌症患者体内巨噬细胞对于肿瘤化细胞的吞噬作用，都是无时无刻不在进行的。针对单核/巨噬细胞内肿瘤来源物质（包括蛋白质、核算、脂类等）的观测，可以为我们提供一个监控体内肿瘤发生、发展的崭新视角，其应用前景必然非常广泛。肿瘤是目前世界第二大死因，严重威胁人类健康。尽管现代医学飞速发展，并且在肿瘤研究和治疗方面也不断大量投入，但是当肿瘤发生局部扩散和远端转移等后期阶段时，现代治疗手段也是一筹莫展，对肿瘤治疗收效甚微；而许多患者的肿瘤在被诊断时已经处于晚期阶段。在过去几十年中，这些晚期肿瘤患者的5年生存率没有发生太大变化。相反的是，早期肿瘤患者的预后相对来说要好很多。现代医学科学的进步和先进的医疗手段对于早期阶段的肿瘤，特别是原位肿瘤的治疗具有显著的疗效。因此，现代医学已经把重点聚焦于肿瘤的早期发现，使肿瘤在发展到晚期之前得到有效的治疗。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生、发展过程中，由肿瘤细胞本身所产生的、或者由机体应对肿瘤细胞而产生的特异性分子。这些分子可以反映肿瘤的存在和进展，往往特异性出现在肿瘤患者，而在正常人不存在、或其表达水平与肿瘤患者相比有显著差异。目前发现的具有临床意义的100多种肿瘤标志物中，有一大部分是存在于患者的血液中，比如许多肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异或癌胚抗原，肿瘤相关抗体或自身抗体等。这些血清中的肿瘤标志物的存在给肿瘤早期的检测和诊断提供了可能和便捷途径。现有的关于肿瘤标志物的检测技术主要包括肿瘤基因测序以及ctDNA测序技术。其中，肿瘤基因测序是应用肿瘤活检组织提取DNA测序，主要用以辅助诊断和指导个体化用药，该检测技术为有创取样，必须先明确肿瘤病灶发生位置，不能用在早诊筛查领域。ctDNA测序是分离富集外周血中游离的肿瘤DNA并进行测序，目前主要应用集中在肿瘤复发监控、用药指导等方面，然而，由于外周血中ctDNA含量稀少，尤其在肿瘤早期阶段收集不到足够用于测序实验的ctDNA量，故该方法应用受到很大限制。单核/巨噬细胞作为有核细胞的重要组分，现有技术一般是通过其表面抗原分子CD14和CD16进行检测的，目前可以买到成熟的抗体。主要的临床应用集中在血细胞组成检测和造血系统肿瘤（如：粒/单核细胞性白血病）方面的检测中，为临床诊断提供重要参考。就目前专利和文献检索来看，将肿瘤抗原与实体肿瘤的监控联系还有待进一步研究。参考文献：（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题1〉研究目标本项目致力于TKTL1和DNASE1L1在肿瘤检测中的应用研究。我们通过在病人血液中寻找吞噬相关的细胞，在这些细胞中寻找肿瘤相关的分子：如蛋白，核酸等。该项目中，我们通过检测巨噬细胞中TKTL1和DNASE1L1的表达量，来确定病人身体内肿瘤发生发展状况，根据本项检测，给病人的肿瘤诊断，治疗及预后提供建议和数据支持。2〉研究内容①TKTL1和DNASE1L1特异性抗体的制备在TKTL1和DNASE1L1蛋白序列中选出抗原性和特异性较好的多肽片段用作抗原，合成多肽免疫小鼠，制备融合细胞株；通过筛选，获得表达量和特异性较好的细胞株，ELISA验证后，大量表达这两个蛋白的抗体，并用荧光分子分别标记这两个抗体。②TKTL1和DNASE1L1特异性抗体验证用流式细胞术的方法验证这两个蛋白抗体的特异性。抗体标记的肿瘤细胞系用流式细胞术的方法检测，统计阳性细胞率来计算该抗体的特异性。在病人的血样中分离出白细胞，TKTL1或DNASE1L1标记后流式细胞术检测，验证抗体的特异性。该实验都采取严格的空白对照和阴性对照。③TKTL1或DNASE1L1阳性的巨噬细胞的检测在病人的血液样品中用CD14和CD16的抗体标记巨噬细胞的表面分子，用TKTL1和DNASE1L1标记巨噬细胞吞噬的肿瘤细胞标志物，流式细胞术分析4中分子阳性的细胞，即TKTL1和DNASE1L1阳性的巨噬细胞，从而获得病人体内是否含有大量的肿瘤细胞的信息。④结果分析和身体状况的预测通过对TKTL1和DNASE1L1阳性的巨噬细胞和TKTL1和DNASE1L1阴性的巨噬细胞进行比较，获得这两类细胞的数量比值，分析这个比值的大小与肿瘤大小和恶性程度的相关性，验证这两个蛋白作为早期肿瘤标志物的可行性，以及这两种蛋白对早期肿瘤预测的灵敏度和特异性。3〉拟解决的关键科学问题通过制备TKTL1和DNASE1L1的特异性抗体，检测巨噬细胞中肿瘤来源的TKTL1和DNASE1L1的量来检测病人体内的肿瘤相关信息。通过大量的临床验本检测分析，得出这两个蛋白与肿瘤的发生发展之间的相关性，以及该蛋白在肿瘤检测中的灵敏度和特异性，从而建立通过检测巨噬细胞中这两个蛋白的量来检测肿瘤的方法。（3）拟采取的研究方案及可行性分析1〉拟采取的研究方法①对TKTL1和DNASE1L1蛋白序列进行分析，获得免疫原性较高和特异性较好的多肽片段。合成多肽，制备抗原。②多肽免疫小鼠，制备融合细胞，筛选后检测抗体的表达量和特异性。③用CD14，CD16，TKTL1和DNASE1L1抗体筛选出含有肿瘤相关分子的巨噬细胞和不含有肿瘤相关分子的巨噬细胞。④通过对大量临床实验结果的分析，得出该检测在肿瘤筛查中的特异性和灵敏度。2〉技术路线3〉实验方案①目的基因的分子克隆与目标蛋白的表达在文献调查及序列比对的基础上，根据NCBI基因序列，从原核生物中提取总RNA，设计引物经过RT-PCR及PCR扩增得到原核细菌Cas3的全长基因，构建表达载体，在原核细胞中表达重组蛋白。②目标蛋白的纯化和鉴定用亲和层析法、离子交换层析等方法纯化重组蛋白；用SDS-PAGE和质谱鉴定重组蛋白表达是否正确；用动态光散射、分子筛鉴定重组蛋白的聚集状态；用核酸结合试验鉴定蛋白的生物学活性。③蛋白的晶体筛选和优化先采用座滴法，使用用商品化晶体筛选试剂盒筛选晶体生长的初始条件，再采用悬挂-滴落蒸发扩散法自配溶液对初筛的晶体条件进行优化，获得最佳分辨率的蛋白晶体。④自由蛋白结构的解析采用X-射线衍射Cas3自由蛋白，用MAR图像探测器获得衍射数据，收集到的数据用HKL2000程序分析，采用制备目的蛋白硒代甲硫氨酸衍生物及重原子浸泡的方法，确定蛋白的相位解，进而解析蛋白质结构。⑤蛋白质功能分析采用凝胶迁移实验（EMSA）等方法对蛋白进行功能分析，通过ITC研究蛋白与核酸的亲和力及结合的稳定性，预测出Cas3蛋白与DNA结合的保守位点，并对这些位点进行突变，研究这些突变位点是否影响蛋白的生物学功能。⑥蛋白与DNA复合物的研究根据功能分析结果，制备Cas3-DNA的复合物，筛选并解析复合物晶体的结构，找出Cas3蛋白与和核酸结合的方式和细节，进一步解释CRISPR/Cas系统对外源病毒及遗传物质入侵的作用机制。4〉可行性分析①本研究小组以CRISPR/Cas系统相关蛋白的结构研究为主要科研方向本研究小组在国内率先开展CRISPR/Cas系统相关蛋白结构研究，先后克隆并表达了多种原核生物I型、II型、III型CRISPR/Cas系统中的Cas1~Cas5、Cas9及Cascade复合体蛋白，进行了大量结构生物学方面的研究，为本项目的研究奠定了基础。②本研究小组已成功解析了部分Cas3蛋白的结构在前期研究中，本研究小组成功克隆并表达了可溶性的原核生物全长Cas3蛋白，功能分析表明，该蛋白具有切割双链和单链DNA的活性，证明其具有生物学活性；通过X-射线晶体学方法，首次解析了Cas3蛋白C-端解旋酶结构域的结构，并获得了一套全长Cas3蛋白的低分辨率硒代甲硫氨酸的数据，求得了初步相位。以上工作为后续结构解析Cas3全长蛋白及Cas3-DNA复合物结构研究创造了条件。③本研究小组所依托的实验平台条件优越本项目已非编码核酸重点实验室为依托，与国家生物大分子实验室公用实验平台，拥有良好的仪器设备，有PCR仪、蛋白/核酸电泳系统、DNA成像仪、大型摇床、细胞高压破碎仪、PFLC快速蛋白纯化仪、purfier蛋白纯化系统、晶体检测专用显微镜及CCD拍照设备、晶体筛选试剂盒、晶体培养室等先进仪器。（4）本项目的特色与创新之处1〉本研究首次开展对原核生物CRISPR/Cas系统中核心蛋白Cas3全长进行结构解析，并研究其与DNA相互作用，对阐明Cas3蛋白全长的结构及其作为解旋酶和核酸酶与DNA相互作用的分子机制具有重要意义。2〉通过对原核生物Cas3蛋白与DNA复合体结构的研究，从结构生物学角度探究Cas3蛋白单体与核酸结合位点的细节，进而揭示Cas3蛋白在CRISPR/Cas系统中参与抵御外源入侵病毒和遗传物质的途径和方式，阐明其如何选择并切割DNA，并最终降解DNA使基因沉默的过程。（5）年度研究计划及预期研究结果1〉第一年度：（2015.1-2015.12）①通过重原子浸泡实验的方法或通过表达、纯化原核生物Cas3蛋白硒代甲硫氨酸衍生物，并对其进行结晶，从而获得Cas3蛋白的相位解，解析Cas3自由蛋白结构。②研究原核生物Cas3蛋白突变体与DNA的相互作用，阐明Cas3蛋白解旋酶及核酸酶作用的先后顺序，设计Cas3蛋白突变体与DNA的复合物。2〉第二年度：（2016.1-2016.12）①通过分析Cas3蛋白结构，找出对Cas3蛋白与核酸结合的位点及关键氨基酸，并通过点突变验证结合位点。②采用生化学手段研究Cas3蛋白