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TouchdownPCR退火温度的设计原则①降落PCR是在同一个pcr管内进行PCR，只是每个循环的温度不同(如每个循环降1度)。一般兼并引物用这种方法多些。②设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物的地位。③由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。④例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。则：从65℃—50℃(每2cycles降退火温度1℃)，再在50℃退火温度下做15个循环。实验中如持续出现假象带(杂带)，则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。⑤touchdownPCR是为了增加反应的特异性，降低非特异产物的产生。在整个反应过程是一个温度由高到低的过程，在温度降低的过程中，会出现一个温度是上下游引物最适的退火温度，大量引物与模板结合，由此产生特异性产物；温度继续降低时，未结合的引物已很少或没有，非特异性产物就很少或没有。设置温度时，高温以Tm较高的引物为准，低温以Tm较低的引物为准.我常用的程序是：65C----50C,1C/2s(2s降低1度）⑥降落PCR（touchdownPCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。