TP63基因多态性与肺癌易感性关系的研究

本科毕业论文（设计）TP63基因多态性与肺癌易感性的研究学院广东药学院专业预防医学年级2009级学生姓名黄科明学号0902501261指导教师刘丽2013年1月诚信声明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）：年月日TP63基因多态性与肺癌易感性关系的研究【摘要】目的探讨TP63基因rs4488809位点单核苷酸多态性与肺癌易感性的关系。方法：对525例肺癌患者与1699例健康正常者采用病例—对照研究。结果：(1)χ2检验显示各种基因型在肺癌组和对照组中分布差异无统计学意义(χ2=0.455，P=0.797)，两组人群等位基因频率差别无统计学意义（χ2=0.271，P=0.60)(2)以TT基因型为参照，在调整性别、年龄和吸烟情况后，经logistic回归分析，发现CC基因型与肺癌发病无统计学关联(校正OR=0.90，95%CI0.68~1.19，P=0.44)；携带CT基因型与携带CC基因型者联合分析，发现（CT+CC）基因型与肺癌发病也无统计学关联（校正OR=0.98，95%CI0.76~1.21，P=0.72）。(3)以突变基因型（CT+CC）而又不吸烟者为参照，在调整性别、年龄后，经logistic回归分析,(CC+CT)基因型并吸烟者OR=1.16(95%CI0.89~1.50)，野生纯合基因型TT而不吸烟者OR=1.08(95%CI0.78~1.51)，野生纯合基因型TT并吸烟者OR=1.13(95%CI0.80~1.58)，均没有显著增加患肺癌的风险。结论：TP63rs4488809基因位点多态性与肺癌易感性无相关性，且基因位点多态性与吸烟不存在交互作用。【关键词】TP63；基因多态性；肺癌易感性ThestudyonthePolymorphismofTP63GeneRS4488809andsusceptibilitytolungcancer[Abstract]Objective:ToinvestigatethepolymorphismoftheTP63geners4488809andsusceptibilitytolungcancer.Methods:Acase-controlstudywasconductedincluded525lungcancerpatientsand1699controlsubjects.Results:(1)TheChi-squaretestsshowedtherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroups(P0.05).(2)FortheTP63-rs4488809C/Tpolymorphism，individualswithCTandCCgenotypewerenotcorrelatedwithlungcancercomparedwithT/Tgenotypeafterstratificationanalysisaccordingtosmoking.(3)Afterstratificationanalysisaccordingtosmoking,itrevealedthatitwasnotassociatedsignificantlyincreasedriskinsmokers.Conclusion:TP63geners4488809polymorphismhasnoassociationwithlungcancer.[Keywords]TP63；singlenucleotidepolymorphism；lungcancersusceptibility11前言肺癌是中国最常见的恶性肿瘤，是病死率最高的恶性肿瘤之一，患病率和发病率随着环境污染及吸烟率的上升在世界上大多数国家逐年上升[1]。根据全国肿瘤防治办公室的统计,肺癌已居我国男性恶性肿瘤发生率和死亡率的第一位,女性恶性肿瘤发生率的第二位和死亡率的第一位[2]。虽然科技的飞速发展极大地改变了医学的面貌,但肺癌的诊断和治疗依然不尽如人意,肺癌的发病率和死亡率较50年前增加了数十倍,且肺癌总的治愈率水平仍然低于15%。目前因为缺乏行之有效的肺癌筛查和早期诊断技术和方法,绝大多数患者就诊时已属晚期,失去了外科治疗的指征。因此提高肺癌治疗效果的关键在于注重肺癌的一级预防和早期诊断,筛查监测肺癌易感人群。肺癌的发生是一个多因素参与、多基因调控、多阶段发生的复杂过程。研究表明影响肺癌的危险因素有吸烟、环境污染、职业、病毒感染、遗传背景、营养、微量元素缺乏等。其中吸烟、环境污染已被公认为是肺癌的最重要的危险因素。然而,肺癌患者80%—90%与吸烟有关,但只有不到20%的吸烟者患肺癌[3],因此,个体患肺癌并非单纯取决于吸烟或环境污染,主要取决于外在因素和基因,即基因与环境之间的相互作用，也就是说，肺癌在很大程度上还取决于个体的遗传易感性[4]。TP63是近年发现的TP53家族成员之一[5]，TP63基因位于染色体3q2—q29区，包含15个外显子和2个启动子(启动子分别位于外显子1和内含子3)。TP63在细胞中存在有多种异构体，包括至少6种主要的TP63蛋白的异构体。由于TP63具有2个不同启动子和多种内含子剪接方式，导致TP63基因编码产生不同亚型的TP63蛋白，故这些异构体可分成两大类：从外显子1开始转录的具有反式激活区的异构体称为TA异构体；从另一个位于外显子3和4之问的外显子3’开始转录的没有反式激活区的异构体称为△N异构体。△N异构体由于3’端剪切方式不同而产生3种不同C末端的异构体，因此再分α、β和γ亚型，其中α异构体为全长的异构体，β异构体为剪切掉外显子13的异构体，γ异构体为剪切掉外显子11～14的异构体[6]。由上游启动子引发的转录，可产生具有转录激活区(TA)的全长TP63同源异构体TAp63α、TAp63β、TAp63γ,由下游启动子开始的转录则产生缺失转录激活区的N端被截短的异构体△Np63α、△Np63β和△Np63γ。2较长TA异构体具有和TP53相似的功能，起着肿瘤抑制因子的作用，而较短ΔN异构体因其缺少了氨基端的片断，从而丢失了抑制生长的转录激活功能，反而转变成为促进细胞生长及存活的转录因子[7，8，9]。细胞通过调节产生不同比例的异构体，在细胞生长和分化的过程中进行快速、准确的调节。这些异构群分子在生物的发育、发生学中起着重要的作用,在细胞中TP63的TA异构体能抑制细胞的无限增殖，而ΔN异构体会促进细胞的生长、存活和迁移，并可以拮抗TP53蛋白和TA异构体的功能，解除其抑制细胞生长及促进细胞调亡的作用。通过同样的机制，ΔN异构体会起到促进肿瘤细胞异常增殖、存活和迁移作用[10，11]。本研究所探讨的SNP位于TP63基因的第l内含子，正是编码TAp63异构体的区域，所以它可能在TP63基因表达过程中发挥重要的调控作用。32材料与方法2.1研究对象本研究包括肺癌患者525例和正常对照1669例。525例肺癌患者来自广药附属医院2009年到2013年1月间入院患者，其中男性360例（68.6%），女性165例（31.4%）。肺癌患者的纳入标准：经临床影像学和病理学检查确诊为肺癌，无性别、年龄、癌症家族史和临床分期的限制。排除标准包括曾经患有其他癌症疾病史以及未知的放、化疗病史者。1699例健康者则是与病例同时期募集于广东药学院附属医院的健康体检人群，其中男性1380例（82.7%），女性289例（17.3%）。正常健康者的纳入标准：无传染病史、慢性病史、肿瘤病史等。2.2资料的收集对病例和对照研究对象采用相同的调查表收集以下信息：包括性别、年龄等人口学特征，生活方式（是否吸烟等）、既往疾病史、肺癌家族疾病史等。吸烟情况按以下标准：每日吸烟量超过1支并且持续半年以上或者戒烟少于1年者定义为吸烟者；每天吸烟少于1支、且短于1年者定义为非吸烟者；戒烟超过1年者定义为曾经吸烟者。2.3血样的采集在知情同意的情况下采集每位研究对象外周静脉抗凝血1ml。病例血样采集在接受肿瘤放化疗之前进行。抗凝血采集完毕后放入负20度冰箱保存。2.4基因组DNA提取2.4.1试剂：天根试剂盒(CL，FG，PK，TB)，异丙醇，70％乙醇(现配)2.4.2仪器：EppendorfCentrifuge5415D常温离心机国华HH-42快速恒温数显水箱4Eppendorf移液器(1ml、100ul、10ul)及相应枪头NANODROP1000Spectrophotmeter微量紫外分光光度计EppendorfConcentrator5301快速反应浓缩仪吸水纸EP管(2.0ml、1.5ml)废液缸手套记号笔2.4.3实验步骤血样采用天根试剂盒(DP319-02)进行抽提，该试剂盒抽提DNA原理为溶液盐析法，试剂盒内包括细胞裂解液CL2×250ml；缓冲液FG120ml；蛋白酶K1ml；缓冲液TB60ml，基本操作步骤如下：图1盐析法提取DNA流程图(1)将保存于-20。冰箱中的抗凝血取出，37。C水浴融解(2)细胞裂解：1ml抗凝血加入1ml细胞裂解液，颠倒混匀100次后12000rpm/ref离心2分钟，弃上清；再加入1.5ml细胞裂解液，快速颠倒混匀至无明显细胞团块后12000rpm/ref离心2分钟，弃上清；(3)蛋白酶消化：配制缓冲液FG和蛋白酶K混合液(两者比例为100:1;见表1)；5加入500mlFG和蛋白酶K混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块；65°C水浴25分钟，期间颠倒混匀数次；(4)异丙醇沉淀(操作轻柔)：加入500ml异丙醇，缓慢颠倒混匀至出现丝状基因组DNA；12000rpm/ref离心5分钟，弃上清；(5)12000rpm/ref离心2分钟，弃上清。再次加入500ul70％乙醇，颠倒50次，离心12000×2min。倒弃上清，将离心管倒置在干净吸水纸上停留至少5分钟。(6)DNA溶解：空气干燥DNA沉淀至所有液体挥发干净；加入200ul缓冲液TB，确保DNA漂浮于TB内。然后55°C水浴溶解DNA4小时后置于4°C冰箱过夜以继续溶解；表1不同体积血样所需各种缓冲液用量(μl)缓冲液血液体积(μl)1003001000300050001000020000细胞裂解液CL25075025007500125002500050000缓冲液FG5015050015002500500010000蛋白酶K0.51.55152550100100%异丙醇501505001500250050001000070%乙醇5015050015002500500010000缓冲液TB10020020030050010001000FG和蛋白酶K混合液1030100300500100010002.5SNP分型2.5.1试剂TaqMan®UniversalPCRMasterMix(2X)双蒸水HEXFAMTaqMan引物TaqMan探针6TaqManSNPGenotypingAssays2.5.2仪器NanoDrop2000Eppendorf冷冻台式离心机低速离心ABI7900HTEppendorf移液器(1ml、100ul、10ul)及相应枪头384孔板2.5.3TaqMan探针技术基本原理TaqMan探针法，也称为荧光定量PCR，是一种高度特异的定量PCR技术，其基本原理是利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，以产生荧光信号。因为探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只能与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(