TUNEL实验步骤

DeadEndTMColormetricTUNELSystem1.概述…………………………………………………………………………………………………………………12.产物成分及贮存条件……………………………………………………………………………………33.测定法规程………………………………………………………………………………………………….…4A．规程文献…………………………………………………………………………………………..4B．组织片段中细胞凋亡的分析步骤………………………………………………………5C．细胞培养中细胞凋亡的检测步骤…………………………………………………..…7D．阳性对照（随机）进行…………………………………………………………………....9E．采用茴香霉素诱导的HL-60细胞凋亡的步骤………………………………...94.故障循迹………………………………………………………………………………………………………105.缓冲液和溶液的成分组成…………………………………………………………………………..106.相关产物……………………………………………………………………………………………………..107.参考文献……………………………………………………………………………………………………..121.概述DeadEndTMColormetricTUNELSystem是一种非放射性系统，用于单个细胞水平上的平上的原位地简单、准确、快速的检测凋亡细胞。TUNEL通过测量DNA的断裂片段（DNA断裂片段可以作为许多细胞类型的细胞凋亡的重要的生物化学指示因子），以此测定组织片段和培养细胞的凋亡死亡细胞。高等真核生物的绝大多数细胞都能够通过一种内在细胞间的自杀程序（例如程序性细胞死亡和细胞凋亡）来进行自我灭亡。细胞凋亡对于生物发育、内稳态和一些疾病十分重要。细胞凋亡具有一些特定的形态学特征，包括泡状膜、细胞核和细胞质皱缩、染色体凝集。细胞凋亡产生的细胞碎片通过胞膜联合形成凋亡小体，凋亡小体易被巨噬细胞和周围细胞吞噬和消化，并且不产生炎症反应。这与类似细胞坏死的细胞死亡恰恰相反，其特征为细胞膨胀、染色体絮凝、膜完整性的缺失、细胞溶解和局部的炎症反应。凋亡细胞中，在内源性核酸内切酶的作用下产生了DNA断裂片段，因此其细胞核中发生了形态学变化。最具代表性地是，凋亡细胞的DNA被分为以180~200bp为单位长度的多聚体片段，这些片段易在琼脂糖凝胶形成梯度。在外侧膝体核（LGN）、Fas抗体处理后的Jurkat细胞系(急性T细胞白血病细胞系)和茴香霉素处理后的HL-60细胞系中，采用轴突切断术诱导大鼠脑组织的神经死亡，并在振动切片机上切为组织片段，清晰地标记出凋亡细胞。DeadEndTMColormetricTUNELSystem在原位标记DNA断裂片段，并在所有系统中经过了证实。这本技术公报包含了检测组织切片和茴香霉素诱导处理的HL-60细胞的细胞凋亡的方法。测定原则DeadEndTMColormetricTUNELSystem采用修饰的TUNEL末端标记凋亡细胞的DNA断裂片段。通过使用末端脱氧核苷酸转移酶、重组子（rTdT）酶，将生物素化的核苷酸结合到DNA的3-OH末端。辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素结合到生物素标记的核苷酸上，并使用过氧化物酶的作用底物、过氧化氢和稳定的铬精色原体二氨基联苯（DAB）进行检测。使用这种方法，凋亡细胞的细胞核被染成深棕色。2.产物成分及贮存条件产物反应大小Cat#DeadEndTMColormetricTUNELSystem40reactionsG7130包括：（辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素）*9.6mLEquilibrationBuffer（平衡缓冲液）*40uLStreptavidinHRP(0.5mg/mL)*40uLBiotinylatedNucleotideMix(2×20uL)*200uLDAB20×Chromogen（铬精色原体）(生物素标记核苷酸混合物)*200uLDABSubstrate(底物)20×Buffer*2×20uLTerminalDeoxynucleotidylTransferase,*200uLHydrogenperoxide20×（过氧化氢）Recombinant(末端脱氧核苷酸转移酶，重组子)*40PlasticCoverslips(塑料盖玻片)*70mLSSC,20×*10mgProteinaseK(蛋白酶K)产物反应大小Cat#DeadEndTMColormetricTUNELSystem20reactionsG7130包括：*4.8mLEquilibrationBuffer（平衡缓冲液）*40uLStreptavidinHRP(0.5mg/mL)*20uLBiotinylatedNucleotideMix(2×20uL)*200uLDAB20×Chromogen(生物素标记核苷酸混合物)*200uLDABSubstrate(底物)20×Buffer*20uLTerminalDeoxynucleotidylTransferase,*200uLHydrogenperoxide20×Recombinant(末端脱氧核苷酸转移酶，重组子)*20PlasticCoverslips(塑料盖玻片)*20mLSSC,20×*10mgProteinaseK(蛋白酶K)贮存条件：在-20℃下贮存平衡缓冲液、rTdT酶、生物素标记核苷酸混合物和蛋白酶K。在4℃下贮存StreptavidinHRP、20×Buffer的DAB底物、20×过氧化氢。在室温条件下贮存20×SSC和塑料盖玻片。○注本系统的不同成分具有不同的贮存条件。在使用前，将系统提供的蛋白酶K在蛋白酶K缓冲液中重建。在-20℃下贮存等份的重组的10mg/mL的蛋白酶K溶解液，在-20℃下酶的稳定性至少能保持6个月。安全事项：平衡缓冲液包含二甲胂酸，避免接触皮肤和眼睛。当使用这种试剂时，戴上眼镜和安全手套。DAB可能是致癌物，当使用这种试剂时，戴上眼镜和安全手套。3.测定方法3.A方法综述在使用DeadEndTMColormetricTUNELSystem前，阅读以下材料。提供给使用者的材料：*磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）*0.3%过氧化氢用于封闭内源性的过氧化物酶*固定剂（例如，10%的缓冲甲醛，4%多聚甲醛，4%不包含甲醇的甲醛）*封固剂○注不要使用系统提供的20×过氧化氢去准备用于封闭内源性过氧化物酶0.3%的过氧化氢溶解液。培养细胞的附加材料：*多聚-L-赖氨酸*0.2%PBS溶解的TritonX-100*DNase-I（例如，RQ1RNase-FreeDNase,Cat#M6101）*DNase缓冲液石蜡包埋的组织切片的附加材料：*二甲苯或者二甲苯替代物[例如Hemo-De清除剂（FisherCat#15-182-507A）]*去离子水稀释的乙醇（100%，95%，85%，70%和50%）*0.85%NaCl溶液*蛋白酶K缓冲液*DNase-I（例如，RQ1RNase-FreeDNase,Cat#M6101）*DNase缓冲液组织切片和细胞培养的附加设备*多聚-L-赖氨酸包被或者硅烷化的显微镜玻片[例如，Poly-Prep玻片（SigmaCat#P0425），重磨砂的玻璃玻片（FisherCat#12-550-15）或者其他预处理的玻片]*玻片染色缸（需要一个单独的缸用于随意的DNase-I阳性对照玻片染色）*钳状骨针*微量移液器*用于显微镜玻片的增湿箱*玻璃盖玻片*37℃的保温箱*显微镜*干净的指甲油和胶布3.B组织切片中的凋亡细胞的分析步骤适用于组织切片的测定步骤需要很多方式准备，包括石蜡组织包埋的切片，冰冻切片和振动切片。对于冰冻切片和振动切片，在第4步开始。1.将石蜡包埋切片和脱蜡组织切片（贴敷于显微镜玻片上）置于染色缸中新鲜的二甲苯，室温浸没5min。重复1次本操作。2.将玻片浸没在100%的乙醇中漂洗，室温5min.3.重复浸没在100%乙醇中漂洗3min，将玻片连续地浸没在不同浓度梯度的乙醇中（95%，85%，70%，50%），室温，每种3min，以此使样品再水化。4.室温，浸没在0.85%NaCl，5min。5.室温，浸没在PBS，5min6.固定组织切片：室温，浸没在4%多聚甲醛或者10%甲醛缓冲液中，15min。7.室温，浸没在PBS，5min。重复1次。8.去除组织切片的水分，并将玻片置于平面上。制备20ug/mL的蛋白酶K：将10mg/mL的蛋白酶K原液按1:500的比例在PBS中稀释。取100uL的20ug/mL蛋白酶K加到每张玻片上，并将组织切片覆盖，室温培育玻片10-30min。○注：蛋白酶K有助于组织的水分渗透，但是培育时间延长可能会使组织滑下玻片。为了获得最佳结果，需要优化培育的时间。较薄的组织切片（例如5-10um的石蜡切片）培养时间较短，较厚的组织切片（例如50um的振动切片）培育时间较长。9.室温，浸没在PBS，5min。10.进一步固定组织切片：室温，浸没在4%多聚甲醛或者10%甲醛缓冲液中，5min。11.室温，浸没在PBS，5min。重复1次。注意：准备阳性对照：用DNaseI处理样品，从而生成DNA断裂片段。DNase的处理方法参见3.D。12.敲击玻片以去除多余的水分。用100uL的平衡缓冲液覆盖细胞组织。室温，平衡5-10min。13.切片平衡时，在冰上解冻生物素标记的核苷酸混合物，并制备足够的rTdT反应混合物，从而用于所有的实验组反应和对照组反应。每张玻片加100uL的反应混合物，以足够覆盖组织切片。rTdT反应混合物的制备细节详见表1.表1rTdT反应混合物的制备缓冲液成分每100uL标准反应数组分体积反应的体积（实验组+阳性对照）平衡缓冲液98uL×__=生物素标记的核苷酸混合物1uL×__=rTdT酶1uL×__=至于阴性对照：制备不含rTdT酶的培育缓冲液：98uL平衡缓冲液，1uL生物素标记的核苷酸混合物和1uL高压的去离子水。通过以下14-24步骤的方法。14.用面巾纸吸干平衡部分周围的水分，并加上100uL的rTdI反应混合物到玻片的组织片段上。不要让切片干燥了。15.用塑料盖玻片盖上切片，以此保证试剂的分布。37℃下，在增湿箱中培育玻片60min，以保证发生末端反应。16.用去离子水按1:10比例稀释20×SSC。去除塑料盖玻片，终止反应：室温，浸没在2×SSC，15min。注意：在稀释前，确保20×SSC中的盐粒都溶解了。17.室温下，浸没在新鲜的PBS中，5min。重复此漂洗，2次，以去除未结合的生物素标记的核苷酸。18.封闭内源性过氧化物酶：室温下，浸没在PBS溶解的0.3%过氧化氢，3-5min。○注：不要用系统提供的20×过氧化氢，去配置封闭过氧化物酶的0.3%的过氧化氢溶液。19.室温，浸没在PBS，5min。重复2次。20.用PBS按1:500比例稀释链霉亲和素HRP。滴加100uL此液到每张玻片，室温下培育30min。21.室温，浸没在PBS，5min。重复2次。22.在使用前才混合DAB。加50uLDABSubstrate20×Buffer到950uL去离子水中，然后加50uLDAB20×Chromogen和50uL20×过氧化氢。滴加100uLDAB溶解液到每张玻片，并显色，直到有了浅棕色的背景。○注：保证DAB溶解液避光，并在30min内使用。23.用去离子水冲洗几次。24.在含水的或者持久的封固剂中封固玻片。[例如，100%丙三醇或者Permount封固剂（FisherCat.#SP-100）]。对于含水的封固剂，需要用指甲油封闭盖玻片的边沿。采用光学显微镜观察染色。3.C培养细胞细胞凋亡的检测步骤准备足够的多聚-L-赖氨酸包被的玻片，用于所有的实验组和对照组。准备多聚-L-赖氨酸包被的玻片用移液管将多聚-L-赖氨酸溶解液（SigmaCat.#P8920,按1:10比例在水中稀释）加到每个