TUNEL检测方法

TUNEL检测方法——DeadEnd™ColorimetricTUNELSystem试剂盒法检测原理：细胞凋亡时，其DNA会产生3′-OH末端，而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT酶)将生物素标记的核苷酸连接到DNA的3′-OH末端。再将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(StreptavidinHRP)结合在此核苷酸上。StreptavidinHRP可与过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。材料试剂盒（G7130）内容：名称量说明平衡缓冲液9.6ml生物素标记的核苷酸混合物40μl2×20μlTdT酶40μl2×20μlStreptavidinHRP40μl0.5mg/mlDAB20XChromogen200μlDABSubstrate20XBuffer200μlHydrogenPeroxide20X200μlSSC,20X70mlProteinaseK10mgPlasticCoverslips40(2×20)储存条件:平衡缓冲液,TdT酶,生物素标记的核苷酸混合物，蛋白酶K：–20°CStreptavidinHRP,DAB20XChromogen,20XDAB底物缓冲液，20X过氧化氢：4°C20XSSC，塑料盖玻片：室温保存需自备：PBS缓冲液0.3%过氧化氢溶液（用以抑制内源性过氧化氢酶）固定液（例如：10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛，4%无甲醇甲醛）封固剂用于组织的检测方法由试剂盒内容制备：20μg/ml蛋白酶K工作液：10mg蛋白酶K＋1ml蛋白酶K缓冲液r→10mg/ml蛋白酶K储备液→20μg/ml蛋白酶K工作液TdT酶反应液（使用时制备）：缓冲液成分每标准100ul反应的成分体积反应次数（实验反应+选择性阳性对照）成分的体积平衡缓冲液98ul×=生物素化的核苷混合物1ul×=rTdT酶1ul×=2XSSC：用去离子水1：10稀释20XSSCStreptavidinHRP工作液：以PBS500：1稀释StreptavidinHRP.DAB混合液（使用时制备，避光，30mins）：950ul去离子水＋50ul20XDAB底物缓冲液＋50ulDAB20X色原体＋50ul20X过氧化氢步骤：1.0.85%氯化钠溶液浸洗5mins（室温）2.PBS浸洗5mins（室温）3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液中固定15mins（室温）4.PBS浸洗二次，每次5mins（室温）5.除去多余液体，滴加100μL20μg/ml蛋白酶K工作液，覆盖组织。置于平面，孵育10--30mins（室温）。6.染色缸内PBS浸洗5mins。（室温）7.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液固定5mins。（室温）8.PBS浸洗二次，每次5mins。（室温）9.除去多余液体，滴加100μL平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，平衡5～10mins（室温）。10.置于冰上，除去多余液体，添加100μLTdT酶反应液，防止干燥。37℃，湿盒中孵育60min，（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。11.染色缸内2XSSC浸洗15mins（用于终止反应）。（室温）12.PBS浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）13.0.3%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温）14.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）15.加100μLStreptavidinHRP工作液，反应30min。（室温）16.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）17.加100μLDAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。18.去离子水漂洗若干次。19.用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。用于细胞的检测方法需自备：Poly-L-Lysine覆盖的切片：在干净的载玻片表面铺poly-L-lysine（可以SigmaCat.#P892010倍稀释于水制得），在所需区域铺一薄层。待干后，迅速以去离子水冲洗，空气干燥30--60mins。4℃可储存7天。0.2%TritonX-100溶液：TritonX-100溶于PBSTdT酶反应液（使用时制备）：缓冲液成分每标准100ul反应的成分体积反应次数（实验反应+选择性阳性对照）成分的体积平衡缓冲液98ul×=生物素化的核苷混合物1ul×=rTdT酶1ul×=2XSSC：用去离子水1：10稀释20XSSCStreptavidinHRP工作液：以PBS500：1稀释StreptavidinHRP.DAB混合液（使用时制备，避光，30mins）：950ul去离子水＋50ul20XDAB底物缓冲液＋50ulDAB20X色原体＋50ul20X过氧化氢步骤：1.将细胞以PBS清洗，重悬后铺于Poly-L-Lysine覆盖的切片上，组织培养罩内空气干燥约15mins2.PBS清洗2次。（室温）3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液，或10%福尔马林浸泡细胞25mins。（室温）4.PBS浸洗二次，每次5mins。（室温）5.0.2%TritonX-100溶液浸洗5mins。（室温）6.PBS浸洗二次，每次5mins。（室温）7.除去多余液体，滴加100μL平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，室温平衡5～10mins。8.置于冰上，除去多余液体，添加100μLTdT酶反应液，防止干燥。37℃，湿盒中孵育60min，（以使末端标记反应发生）。（过程中应防止干燥）。9.染色缸内2XSSC浸洗15mins（用于终止反应）。（室温）10.PBS浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）11.0.3%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min（用以抑制内源性过氧化氢酶）。（室温）12.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）13.加100μLStreptavidinHRP工作液，反应30min。（室温）14.PBS浸洗三次，每次5min。（室温）15.加100μLDAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。16.去离子水漂洗若干次。17.用水或永久的封片剂封片，水封片剂周围用指甲膏封住，显微镜下观察染色。附：用于细胞的检测方法——非试剂盒法TUNEL法检测SK-N-SH细胞的凋亡1.SK-N-SH细胞于激光共聚焦专用玻璃培养皿中，PBS洗涤，用4%的多聚甲醛（以0.1mol/L42PONaH为溶剂，pH=7.4)固定细胞15min；2.PBS洗涤3次，每次5min3.含有0.5%Tween-20和0.2%BSA的PBS室温孵育15min4.PBS洗涤2min5.每孔加入50μLTdT混合物(TdT缓冲液∶Biotin-dUTP∶TdT为90∶5∶5，体积比，现配现用)室温孵育60min6.吸弃TdT混合物，加入1×TB室温作用5min7.PBS洗涤4次，每次2min；每孔滴加50μL的封闭液室温处理20min8.现配的avidin-FITC溶液(用封闭液稀释)室温避光处理30min9.PBS洗涤3次，每次5min；10.200μL的DAPI室温作用6min，11.PBS洗涤3次，每次5min。12.激光共聚焦显微镜下观察，于高倍显微镜下(×400)每组随机选取视野，计数凋亡细胞数和细胞总数(每组不少于200个)。