TUNEL检测方法

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TUNEL检测方法——DeadEnd™ColorimetricTUNELSystem试剂盒法检测原理:细胞凋亡时,其DNA会产生3′-OH末端,而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT酶)将生物素标记的核苷酸连接到DNA的3′-OH末端。再将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(StreptavidinHRP)结合在此核苷酸上。StreptavidinHRP可与过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。材料试剂盒(G7130)内容:名称量说明平衡缓冲液9.6ml生物素标记的核苷酸混合物40μl2×20μlTdT酶40μl2×20μlStreptavidinHRP40μl0.5mg/mlDAB20XChromogen200μlDABSubstrate20XBuffer200μlHydrogenPeroxide20X200μlSSC,20X70mlProteinaseK10mgPlasticCoverslips40(2×20)储存条件:平衡缓冲液,TdT酶,生物素标记的核苷酸混合物,蛋白酶K:–20°CStreptavidinHRP,DAB20XChromogen,20XDAB底物缓冲液,20X过氧化氢:4°C20XSSC,塑料盖玻片:室温保存需自备:PBS缓冲液0.3%过氧化氢溶液(用以抑制内源性过氧化氢酶)固定液(例如:10%缓冲的福尔马林,4%多聚甲醛,4%无甲醇甲醛)封固剂用于组织的检测方法由试剂盒内容制备:20μg/ml蛋白酶K工作液:10mg蛋白酶K+1ml蛋白酶K缓冲液r→10mg/ml蛋白酶K储备液→20μg/ml蛋白酶K工作液TdT酶反应液(使用时制备):缓冲液成分每标准100ul反应的成分体积反应次数(实验反应+选择性阳性对照)成分的体积平衡缓冲液98ul×=生物素化的核苷混合物1ul×=rTdT酶1ul×=2XSSC:用去离子水1:10稀释20XSSCStreptavidinHRP工作液:以PBS500:1稀释StreptavidinHRP.DAB混合液(使用时制备,避光,30mins):950ul去离子水+50ul20XDAB底物缓冲液+50ulDAB20X色原体+50ul20X过氧化氢步骤:1.0.85%氯化钠溶液浸洗5mins(室温)2.PBS浸洗5mins(室温)3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液中固定15mins(室温)4.PBS浸洗二次,每次5mins(室温)5.除去多余液体,滴加100μL20μg/ml蛋白酶K工作液,覆盖组织。置于平面,孵育10--30mins(室温)。6.染色缸内PBS浸洗5mins。(室温)7.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液固定5mins。(室温)8.PBS浸洗二次,每次5mins。(室温)9.除去多余液体,滴加100μL平衡缓冲液,覆盖组织。置于平面,平衡5~10mins(室温)。10.置于冰上,除去多余液体,添加100μLTdT酶反应液,防止干燥。37℃,湿盒中孵育60min,(以使末端标记反应发生)。(过程中应防止干燥)。11.染色缸内2XSSC浸洗15mins(用于终止反应)。(室温)12.PBS浸洗三次,每次5min,(用于移去未结合的生物素标记的核苷酸)。(室温)13.0.3%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min(用以抑制内源性过氧化氢酶)。(室温)14.PBS浸洗三次,每次5min。(室温)15.加100μLStreptavidinHRP工作液,反应30min。(室温)16.PBS浸洗三次,每次5min。(室温)17.加100μLDAB混合液,直到呈现浅棕色背景,但背景不可太深。18.去离子水漂洗若干次。19.用水或永久的封片剂封片,水封片剂周围用指甲膏封住,显微镜下观察染色。用于细胞的检测方法需自备:Poly-L-Lysine覆盖的切片:在干净的载玻片表面铺poly-L-lysine(可以SigmaCat.#P892010倍稀释于水制得),在所需区域铺一薄层。待干后,迅速以去离子水冲洗,空气干燥30--60mins。4℃可储存7天。0.2%TritonX-100溶液:TritonX-100溶于PBSTdT酶反应液(使用时制备):缓冲液成分每标准100ul反应的成分体积反应次数(实验反应+选择性阳性对照)成分的体积平衡缓冲液98ul×=生物素化的核苷混合物1ul×=rTdT酶1ul×=2XSSC:用去离子水1:10稀释20XSSCStreptavidinHRP工作液:以PBS500:1稀释StreptavidinHRP.DAB混合液(使用时制备,避光,30mins):950ul去离子水+50ul20XDAB底物缓冲液+50ulDAB20X色原体+50ul20X过氧化氢步骤:1.将细胞以PBS清洗,重悬后铺于Poly-L-Lysine覆盖的切片上,组织培养罩内空气干燥约15mins2.PBS清洗2次。(室温)3.4%多聚甲醛溶液或含10%福尔马林的PBS溶液,或10%福尔马林浸泡细胞25mins。(室温)4.PBS浸洗二次,每次5mins。(室温)5.0.2%TritonX-100溶液浸洗5mins。(室温)6.PBS浸洗二次,每次5mins。(室温)7.除去多余液体,滴加100μL平衡缓冲液,覆盖组织。置于平面,室温平衡5~10mins。8.置于冰上,除去多余液体,添加100μLTdT酶反应液,防止干燥。37℃,湿盒中孵育60min,(以使末端标记反应发生)。(过程中应防止干燥)。9.染色缸内2XSSC浸洗15mins(用于终止反应)。(室温)10.PBS浸洗三次,每次5min,(用于移去未结合的生物素标记的核苷酸)。(室温)11.0.3%过氧化氢的PBS中浸洗3-5min(用以抑制内源性过氧化氢酶)。(室温)12.PBS浸洗三次,每次5min。(室温)13.加100μLStreptavidinHRP工作液,反应30min。(室温)14.PBS浸洗三次,每次5min。(室温)15.加100μLDAB混合液,直到呈现浅棕色背景,但背景不可太深。16.去离子水漂洗若干次。17.用水或永久的封片剂封片,水封片剂周围用指甲膏封住,显微镜下观察染色。附:用于细胞的检测方法——非试剂盒法TUNEL法检测SK-N-SH细胞的凋亡1.SK-N-SH细胞于激光共聚焦专用玻璃培养皿中,PBS洗涤,用4%的多聚甲醛(以0.1mol/L42PONaH为溶剂,pH=7.4)固定细胞15min;2.PBS洗涤3次,每次5min3.含有0.5%Tween-20和0.2%BSA的PBS室温孵育15min4.PBS洗涤2min5.每孔加入50μLTdT混合物(TdT缓冲液∶Biotin-dUTP∶TdT为90∶5∶5,体积比,现配现用)室温孵育60min6.吸弃TdT混合物,加入1×TB室温作用5min7.PBS洗涤4次,每次2min;每孔滴加50μL的封闭液室温处理20min8.现配的avidin-FITC溶液(用封闭液稀释)室温避光处理30min9.PBS洗涤3次,每次5min;10.200μL的DAPI室温作用6min,11.PBS洗涤3次,每次5min。12.激光共聚焦显微镜下观察,于高倍显微镜下(×400)每组随机选取视野,计数凋亡细胞数和细胞总数(每组不少于200个)。

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