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1主题内容与适用范围本标准规定了用高效液相色谱法测定食物中维生素A和维生素E。本标准适用于食物中维生素A和维生素E的测定。第一篇高效液相色谱法2原理样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。最小检出量分别为VA：0.8ng；α－E：91.8ng；γ－E：36.6ng；δ－E：20.6ng。3试剂实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。3.1无水乙醚：不含有过氧化物。3.1.1过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。3.1.2去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。3.2无水乙醇：不得含有醛类物质。3.2.1检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。3.2.2脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。3.3无水硫酸钠。3.4甲醇：重蒸后使用。3.5重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。3.610%抗坏血酸溶液(m/V)：临用前配制。3.71∶1氢氧化钾溶液。3.810%氢氧化钠溶液(m/V)。3.95%硝酸银溶液(m/V)。3.10银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。3.11维生素A标准液：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。3.12维生素E标准液：α－生育酚(纯度95%)，γ－生育酚(纯度95%)，δ－生育酚(纯度95%)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。3.13内标溶液：称取苯并〔e〕芘(纯度98%)，用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10μg苯并〔e〕芘的内标溶液。3.14pH1～14试纸。4仪器和设备4.1实验室常用设备。4.2高压液相色谱仪带紫外分光检测器。4.3旋转蒸发器。4.4高速离心机4.4.1小离心管：具塑料盖1.5～3.0mL塑料离心管(与高速离心机配套)。4.5高纯氮气。4.6恒温水浴锅。4.7紫外分光光度计。5操作步骤5.1样品处理5.1.1皂化称取1～10g样品(含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL10%抗坏血酸，苯并〔e〕芘标准液2.00mL，混匀。加10mL1：1氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。5.1.2提取5.1.2.1将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。5.1.3洗涤5.1.3.1用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。5.1.4浓缩5.1.4.1将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250～300mL球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。5.1.5将乙醇液移入一小塑料离心管中(4.4.1)，离心5min(5000rpm)。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。5.2标准曲线的制备5.2.1维生素A和维生素E标准浓度的标定方法取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如下表所示。表1浓度计算：5.2.2标准曲线的制备本方法采用内标法定量。把一定量的维生素A、γ－生育酚、α－生育酚、δ－生育酚及内标苯并〔e〕芘液混合均匀。选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程70%，为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并〔e〕芘的浓度值不变)，用此二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。本方法不能将β－E和γ－E分开，故γ－E峰中包含有β－E峰。5.3高效液相色谱分析5.3.1色谱条件(推荐条件)5.3.1.1预柱：ultrasphereODS10μm，4mm×4.5cm。5.3.1.2分析柱：ultrasphereODS5μm，4.6mm×25cm。5.3.1.3流动相：甲醇∶水＝98∶2。混匀。于临用前脱气。5.3.1.4紫外检测器波长：300nm。量程0.02。5.3.1.5进样量：20μL。5.3.1.6流速：1.7mL/min。5.4样品分析取样品浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。5.4.1定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。5.4.2定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。6计算式中：X2——某种维生素的含量，mg/100g；C——由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL；V——样品浓缩定容体积，mL；m——样品质量，g。用微处理机二点内标法进行计算时，按其计算公式计算或由微机直接给出结果。7结果的允许差同一实验室，同时测定或重复测定结果相对偏差绝对值≤10%。