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Westernblot1.实验的原理2.试剂的配制3.实验的步骤4.凝胶图象分析实验的原理实验室所用的试剂的配方参考TAKARA分子实验常用配方手册蛋白样品的制备•SDS-PAGE•转膜•封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色实验的步骤蛋白样品的制备参考RIPA裂解液的说明书：对于培养细胞样品：1.取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，PMSF的工作浓度为1X2.对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗两遍。加入适量的裂解液（约为细胞体积的5-7倍），用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上放置20min，14000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。3.对于悬浮细胞，2500g离心5min收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液漂洗细胞，2500g离心5min收集细胞,加入适量裂解液.（约为细胞体积的5-7倍）。用移液器吹打数下，把细胞吹散，冰上孵育20min，14000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。对于组织样品：1.手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织称量后切成几个较小的组织块放入匀浆器中。2.取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1x。3.按组织净重（g）：裂解液(ml)=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。4.匀浆器匀浆,冰上孵育20min，直至充分裂解。5.充分裂解后,14000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提蛋白浓度的测定使用BCA法测，详细步骤参考说明书:(1)取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mgBSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可-20℃长期保存；(2)稀释标准品：取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至0.5mg/ml(蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品)。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可-20℃长期保存；(3)配制BCA工作液：按50体积试剂A加1体积试剂B配制适量工作液，充分混匀（配制的量视样本量而定，200µl/孔）。工作液室温24小时内稳定。(4)加标准品：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加入96孔板的标准品孔中（做副孔），加标准品稀释液补足到20µl。(5)加样品：加2μl样品到96孔板的样品孔中，加18μlPBS(好用1%SDS或裂解液，保持与原样本中的一致)，使总体积达到20μl。(6)加工作液：每孔加入200µl步骤2所配制工作液。(7)37℃静置20-30分钟。可室温放置2小时。(8)酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。(9)EXCEL绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。附SDS－PAGE电泳不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。【SDS-PAGE基本原理】SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关SDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比SDS-PAGE凝胶的有效分离范围SDS－PAGE电泳详细过程（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）2、根据蛋白大小配制一定浓度的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。WesternBlot灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%异丁醇：8%4、按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）6、测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至PCR管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。（5×SDS上样缓冲液事先跟巯基乙醇按1ml加50ul配好。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性WesternBlot灌制积层胶插入梳子7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液枪的枪头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出），没加一个样品要换一次枪头（3）电泳电泳时间一般1.5h，电压为浓缩胶80V较好，分离胶120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。WesternBlotStakinggelSeparatinggel转膜（1）转一张膜需准备6张5x9cm的滤纸和1张4x8cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的膜置于甲醇中浸15秒才可使用。（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用恒流300mA,转2h（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。(此步可以省略)免疫反应（1）将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）。剪一大小合适的杂交袋，取出膜，在滤纸上沾几下（PVDF膜需保持湿的状态），放入杂交袋中，加入一抗后，用封口机封闭在袋内，赶尽气泡，4℃过夜（指12小时）。或者室温摇床1.5h.取出滤膜用TBST漂洗3次，每次10min（室温，平缓摇动）。（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1.5h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min；化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X光片夹中◦（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。全程不要用镊子去夹。凝胶图象分析•将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统对目的条带进行光密度定量。计算出相对表达量，然后作条形图。常见的一些问题与分析•1.暗处观察膜，明明发现只有一条荧光带，为何我显影出来的条带却很多，形成了拖尾现象？•答：主要是将胶片放到膜上后，还在拖动它，取出胶片的时候，要小心，尽量不要拖动胶片，可以将整个压片盒倒转过来打开。•2.为何每次洗出来的条带都是很粗，每个样品之间的间隔很小呢？•答：这是一个常见的问题，有些人的做法是减少上样量，但最后还是出现了同样的问题。其实关键在于显影的技巧，当胶片在显影液中，刚出现条带时，叫要立刻拿上来了，然后条带会慢慢变粗，当达到想要的效果时，立刻放到定影液中定影。•3.胶带显影出来后，出现了几条条带，我怎么知道哪个是我们的目的条带，还有哪个样品是多少号怎么看？•答：显影完后，晾干，拿去跟膜进行对照，根据mark的大小标出相应条带的大小，这里关键在于，压片的时候，放胶片一定要按正确的方式放，一般胶片半圆角的两边要跟压片盒的左上角的两边紧挨着对齐。用梳子去跟膜和胶片匹对就可以找出每个加样孔的位置了。•4.为什么我转膜后，没有看到膜上有marker?•答：很有可能是你转膜的时，方向搞错了，黑胶白膜，夹子黑的一面要跟电泳槽黑的一面对齐，白的一面跟电泳槽红的一面对齐。•5.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。