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WesternBlot1.收集、制备蛋白样品(Proteinsamplepreparation)（1）收集细胞于1.5mlEP管中，加入适当的裂解液，例如RIPA细胞裂解液或NP-40裂解液，裂解细胞。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。测定方法具体见试剂盒。（2）测完蛋白含量后，计算含20-50μ蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。2.电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制ⅰ、清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手用棉球蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲干净，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干（风机吹干）。ⅱ、灌胶与上样：玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml注射器吸取胶沿玻璃缓慢放出放出，待胶面升到绿线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时，胶完全充满玻璃槽底部之前要慢一些，然后可以加快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了(室温20℃左右时约需要30min，温度越低时间越长)。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后(室温20℃越需要20分钟左右)，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。将其放入电泳槽中，用电泳液冲洗一下浓缩胶加样孔加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中，缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）。(2)上样与电泳装好电泳仪，加入电泳液，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用蛋白marker。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3.转膜(Transfer)推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。(1)切胶：要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。(2)备膜：裁剪硝酸纤维素膜和滤纸，膜的大小：9cm*6cm，滤纸大小：10cm*7cm。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于甲醇中放置5min，使之从不透明变透明，将处理好的硝酸纤维素膜放入转膜缓冲液中平衡5min。(3)装膜：将转膜用的夹子打开使黑的一面（负极）保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫上(2)中浸泡好的滤纸，随后按照凝胶—硝酸纤维素膜—滤纸—海绵垫的顺序依次叠放，注意每一层都不能有气泡（如有气泡可用玻璃棒轻轻赶压）。最后将白色板（正极）盖好装入转膜槽中。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通，最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置）。(4)转膜：将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的的周围放置冰来降温。本实验室使用100V转膜1-1.5h，或采用300mA转膜1h。还可根据蛋白分子量的大小确定转膜时间。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。4.封闭(Blocking)封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合，我们一般用non-fatmilk。在转膜结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液（TBST）中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。倒掉洗涤液之后加入Western封闭液(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。倒掉封闭液，将膜封入PE手套中，立即加入稀释好的一抗，密封好，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入TBST，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。倒尽TBST后，再加入TBST，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。倒尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000至1:10000。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗。孵育完二抗后，用TBST洗涤10min*3次。8．化学发光，显影，定影增强化学发光法(ECL)增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来。(1)将硝酸纤维素膜转入暗室(注意保持膜湿润)，在保鲜膜上将素膜沥干。(2)将两种显色底物1:1等体积混合（一般各1ml/membrane）。将混合物均匀覆盖在膜表面，1-2分钟。大约1min后，去尽残液，包好(平整盖上保鲜膜)，放入X-光片夹中。用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,并确定干的表面与胶片接触.(3)在暗室中，剪相同大小的胶片，置硝酸纤维素膜上，作好标记，一旦放上便不能移动，关上暗盒发光。开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min-5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。(4)曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影1min(20～25℃)，温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间，显影结束后，马上把X-光片浸入超纯水中洗涤1min，然后再放入定影液中，定影时间一般为1min，以胶片透明为止，最后在超纯水中洗涤1min，洗掉多于定影液，取出室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体）9.膜的重复利用(Membranerecovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜（strip），以重复利用蛋白膜。Strip可以用0.2M的NaOH，洗膜10min。Buffer配方：裂解液的制备：1、组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL50mmoL/LPH7.42:Nacl150mmoL/L3:去氧胆酸钠0.25%4：NP-40或Triton-x-1001%5:EDTA1mmoL/L6：PMSF1mmoL/L7：Aprotinin1μg/ml8:leupeptin1μg/ml9:pepstain1μg/ml其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。2、细胞裂解液：1：NP-40裂解体系：150mmoL/LNacl1.0%NP-40或Triton-x-10050mmoL/LTris(PH8.0)2：RIPA裂解体系：150mmoL/LNacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脱氧胆酸钠0.1%SDS50mmoL/LTris(ph8.0)注意事项：1、制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（裂解液中要加入合适的蛋白酶抑制剂）。2、样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃或-20℃中保存，但要注意不要反复冻融，反复冻融会使蛋白质降解。3、分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。4、凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。5、胶凝的过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或失效。6、未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内。7、加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。8、注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。9、上样时小心不要使样品溢出而污染相邻加样孔。10、为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。11、电泳中常出现的一些现象：︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。12、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。13、滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸=膜=胶。14、滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。15、因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须